重视循环肿瘤细胞分子检测在非小细胞肺癌的临床应用

曾瑄 梁智勇

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重视循环肿瘤细胞分子检测在非小细胞肺癌的临床应用

Pay attention to clinical application of circulating tumor cells test in non small cell lung cancer

曾瑄 梁智勇

梁智勇，主任医师，教授，博士生导师,北京协和医院病理科主任。现任中华医学会病理学分会侯任主任委员，中国医师学会病理科医师分会副会长，中国医疗保健国际交流促进会理事/病理专业委员会常务副主任委员，中国研究型医院学会病理专业委员会副主任委员，中华医学会病理学分会、中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会及国家卫生计生委病理质控中心分子病理组组长，北京医学会病理学分会副主任委员，《诊断病理学杂志》总编，《中华病理学杂志》、《临床与实验病理学杂志》、《Endocrine Pathology》、《Chronic Diseases》and《Translational Medicine》编委。

非小细胞肺癌； 循环肿瘤细胞； 分子检测

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)是在恶性肿瘤患者血液中发现的一种源于肿瘤的上皮细胞。一般来说，CTCs极其罕见，与白细胞的比率大约为1︰106-107。所以CTCs富集技术的突破是该研究得以深入进行的必要前提。美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)曾先后批准了基于上皮标记(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)的CTCs获取并计数的技术平台(cellsearch)用于乳腺癌、结直肠癌及前列腺癌的预后评估。2015年中国食品和药物管理局(China Food and Drug Administration, CFDA)批准了上皮源性的CTC检测试剂盒用于转移性乳腺癌的监测。

近来，相关研究显示CTCs也可在非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)的诊断、生物学特性的确认和疾病监测中发挥重要的作用，而随着技术的发展，CTCs分子特征的检测更突显出其独特的临床价值。比如，在某些特定的情况下，由于组织或细胞病理学材料无法获取，并且在疾病进程中难以实现多次活检，为及时了解肿瘤生物学特征的变化而适时采取有效治疗措施，CTCs检测可提供很好的帮助。

CTCs的富集主要包括基于物理的和生物的两类方法，前者包括膜过滤(如ISET)、芯片过滤(如Cluster Chip)、密度梯度离心(如Ficoll.Paque)、声动力(如Acoustophoresis Chip)及电泳(如DEPArray)等；后者主要包括正向(选择CTCs，如cellsearch)和负向(选择白细胞, 如CTC.iChip)免疫富集法等[1]。

起初，CTCs的检测方法，主要是针对核酸和蛋白特征，例如通过逆转录聚合酶链反应(reverse transcript polymearse chain reaction, RT-PCR)检测肿瘤细胞mRNA的差异表达来推断CTCs的存在；而定量PCR的使用, 与普通PCR相比, 又进一步提高了灵敏度和特异性。但此类技术因缺乏形态学及数目等重要信息，而被新技术取代，以计数为主要目标的CTC技术则成为主流。随后，在此基础上不断迭代更新，衍生出诸多更优化的平台。目前应用最多的是基于上皮细胞标记(生物法)和上皮细胞大小(物理法)而分离肺癌CTCs 的方法，例如cellsearch和ISET等。前者结合了免疫磁珠标记和自动数字显微镜技术，先以纳米磁珠包被的抗EpCAM的抗体富集上皮细胞，然后分别以荧光标记的抗CK和CD45的抗体检测富集的标本，再行自动显微成像计数分析；后者是一种基于细胞大小的微膜过滤技术，因为大多数肿瘤细胞直径大于(>8 μm)白细胞, 富集的细胞可以于微膜上进行染色及进一步分析。它既可获取单个CTCs，也可获取循环肿瘤微栓(circulating tumor microemboli, CTM)，而且规避了cellcearch技术的假阳性(EpCAM表达的非肿瘤细胞)和假阴性(上皮间质转化时EpCAM高表达缺失)；但该方法仍有小的CTCs可能被漏检，而大的白细胞可能被截留等不足。

鉴于上述工作的积累，涌现出了更多的CTCs技术平台，例如除了考虑混合间质标记(如OncoCEE)外，还结合相关生物标记(如liquid biopsy)以及物理方法(如GEDI)等。这些方法在提高CTCs的富集效率和完善体系等方面，做了有意义且较成功地探索。

近来，一种体内捕获CTCs的技术(GILUPI CellCollector，DiagnostikNet, German)在肺癌研究中得以有效地尝试，它是通过肘静脉留针(30 min)的方式获取与附着抗体结合的上皮细胞。因不受采血量的限制，规避了肺癌可能因上皮间质转化(epithelial to mesenchimal transition, EMT)高发所带来的上皮标记阳性细胞减少而难于获取目标CTCs的问题；但若要对获取器上的CTCs进行形态学染色分析，则将是面临的一个新的挑战。CTC的技术发展很快，新技术不断涌现并弥补了原有方法的各种不足，但最终目的是力求在改进和创新中逐步完善。当下，各种平台互补是大多数学者最多采用的策略[2]。

近年来, 随着分子检测技术的发展, 以及患者全程精细化管理的需求, 国内液体活检技术也有了突破性进展, 以血液游离DNA(cell-free DNA, cfDNA)为代表的液体活检(liquid biopsy)技术, 已陆续获批CFDA而用于临床常规, 成为组织或细胞标本不足以满足分子标记，如表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突变，检测需求时的补充材料，并先后于2015年和2016写入肺癌的相关诊疗指南中[3-4]。随后，中国学者采用纳米基质包被抗体的技术(Nano Velcro)，显著提高了肺癌CTCs的捕获效率[5]。与以往相比，在液体活检的探索中，国内的发展呈现出更快更强的势头。

目前，绝大多数常规分子标记检测技术均可以在CTCs上有效地实施，如PCR, FISH及IHC等，这一点十分重要。肺癌的分子分型是制定有效的个体化治疗方案的重要参考依据。譬如EGFR基因敏感突变(如19外显子缺失或21外显子L858R)的患者，是EGFR 酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)，如(易瑞沙(gefitinib)、凯美纳(conmana)、特罗凯(tarceve)及阿法替尼(afatinib)等获益的候选人群；淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)或ROS1基因重排的患者，治疗则首选ALK抑制剂，如克唑替尼(crizotinib)；而PD-L1表达阳性的患者对免疫检查点抑制剂(如派姆单抗Keytruda)显示出具有很好的疗效[6]。CTCs分子特征的检测，尤其针对治疗过程中(实时组织活检很难实现)及时发现耐药并适时调整后续治疗方案(T790M 将受益于靶向药AZD9291)，具有重要的意义。

Maheswaran等[7]以ARMS法同时检测了27例NSCLC的CTCs和cfDNA标本，并以原发灶组织活检作为对照，检出EGFR基因突变率分别为92%和33%。Ran等[8]以负向富集法获取了37例NSCLC患者的CTCs后，采用激光显微切割分离出单个CTCs并进行全基因组扩增，继而以PCR测序检出EGFR基因19外显子缺失、L858R和T790M分别为85%、55%和45%。Marchetti等[9]以cellSearch获取CTCs后，以NGS检出EGFR基因突变率为84%，与组织学结果一致。Pailler等[10]采用上皮和间质双标记富集CTCs后，以FISH法检测了ALK重排，全部18例组织标本ALK阳性的患者中，均检出数量不等的CTCs，并且具有ALK重排特征，其中包括上皮标记阴性的CTCs(EMT)，而且CTCs之间存在异质性(分别具有3’/5’分离或仅有3’信号的特征)；Pailler等[11]针对4例组织学ROS1阳性的NSCLC患者，以ISET法均检出了CTCs，且以FISH法确认均为ROS1阳性，与组织学结果一致，而且发现CTCs之间存在遗传异质性(ROS1基因拷贝数不同)。

与已知的其它几种较易发现CTCs的肿瘤相比，肺癌可能有更高的EMT机率，凭借传统的基于上皮标记的富集技术往往难以得到可靠稳定的CTCs数据，而且也不能准确反映肿瘤的变化特征；而若采用一组上皮与间质混合抗体进行CTCs捕获，虽然一定程度上克服了上述不足，但仍存在尚待一些解决的问题。Schehr JL等，采用含有上皮和间质标记(EpCAM, MUC1或Vimentin)的组合抗体富集NSCLC的CTCs，发现几种常用抗体对CTCs均有不同程度的误识别(例如 CD11b+骨髓细胞)，而CD45表达缺失的中性粒细胞和不成熟的骨髓细胞也会有一定程度的PD-L表达，这将影响PD-L1表达阳性CTCs的准确检出[12]。

与仅辨别有否CTCs或其数量的变化相比，CTCs的分子特征检测具有更重要的临床意义，它除了可以揭示肿瘤进展过程中分子变化规律，为寻求针对性地治疗措施提供理论依据外，也是深入了解耐药的分子基础及肿瘤异质性特征的最佳材料，可为研发特异性的靶向药或相关治疗手段提供重要信息。另外，尚存在大多数CTCs检测技术操作环节多，分析过程复杂，易受人为因素影响等有待改进之处。期待随着研发技术的更新与突破、研究数据的大量积累，具有高效富集、自动化程度高、性能稳定、识别准确、可操作性强的CTCs系统，在不远的未来应用于临床。

1 Ferreira MM, Ramani VC, Jeffrey SS. Circulating tumor cell technologies [J]. Mol Oncol, 2016, 10(3): 374-394.

2 Hofman V, Ilie MI, Long E, et al. Detection of circulating tumor cell as a prognostic factor in patients undergoing radical surgery for non small cell lung carcinoma: comparison of the efficacy of the CellSearch AssayTM and the isolation by size of epithelial tumor cell method[J]. Int J Cancer, 2011, 129(7): 1651-1660.

3 《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》制订专家组. 非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识[J]. 中华医学杂志, 2015, 95(46): 3721-3726.

4 中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家组.中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家共识(2016版)[J]. 中华病理学杂志, 2016, 45(4): 217-220.

5 Lin M, Chen JF, Lu YT, Nanostructure Embedded Microchips for Detection, Isolation, and characterization of circulating tumor cells[J]. Acc Chem Res, 2014, 47(10): 2941-2950.

6 Herbst RS, Baas P, Kim DW, et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial[J]. Lancet, 2016, 387(10027): 1540-1550.

7 Maheswaran S, Sequist LV, Nagrath S, et al. Detection of mutation in EGFR in circulating lung-cancer cells[J]. N Engl J Med, 2008, 359(4): 366-377.

8 Ran R, Li L, Wang M, et al. Determination of EGFR mutations in single cells microdissected from enriched lung tumor cells in peripheral blood[J]. Anal Bioanal Chem, 2013, 405(23): 7377-7382.

9 Marchetti A, Del Grammastro M, Felicioni L, et al. Assessment of EGFR mutations in circulating tumor cell preparations from NSCLC patients by next generation sequencing: toward a real-time liquid biopsy for treatment[J]. PLoS One, 2014, 9(8): e103883.

10 Pailler E, Adam J, Barthélémy A, et al. Detection of circulating tumor cells harboring a unique ALK rearrangement in ALK-positive non-small-cell lung cancer[J]. J Clin Oncol, 2013, 31(18): 2273-2281.

11 Pailler E, Auger N, Lindsay CR, et al. High level of chromosomal instability in circulating tumor cells of ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer[J]. Ann Oncol, 2015, 26(7): 1408-1415.

12 Schehr JL, Schultz ZD, Warrick JW, et al. High specificity in circulating tumor cell identification is required for accurate evaluation of programmed death-ligand 1[J]. PLoS One, 2016, 11(7): e0159397.

(本文编辑：张大春)

曾瑄，梁智勇. 重视循环肿瘤细胞分子检测在非小细胞肺癌的临床应用[J/CD]. 中华肺部疾病杂志： 电子版， 2016， 9(6)： 587-589.

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.06.001

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2016-11-23)