七厘散含药血清对大鼠雪旺细胞增殖分化的影响

王罡 刘大凯 赵钢 迟晓飞

现已证明周围神经的再生能力主要归因于雪旺细胞, 当周围神经损伤时 , 雪旺细胞可通过分泌神经因子、产生促突起生长因子、与再生轴突形成缝隙连接和紧密连接对神经再生发挥重要作用［1］。雪旺细胞的生物学特性决定了其是周围神经再生过程中的重要种子细胞, 并正成为周围神经损伤修复领域中的研究热点。七厘散由血竭、红花、乳香、没药、儿茶、冰片、麝香等组成, 具有活血化瘀, 消肿止痛的功效,临床多用于创伤后神经组织出血、水肿、微循环障碍、减缓由缺血缺氧导致的细胞凋亡［2］。为了解周围神经损伤后中药七厘散是否可以促使雪旺细胞增殖分化, 从而促进周围神经损伤后的修复问题, 设计了本实验。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 2月龄SD大鼠4只, 雌雄不限, 体重(180±30)g,均由大连医科大学SPF动物实验中心提供。动物均为实验用合格应用, 处理原则符合动物实验伦理学标准。

1.2 方法

1.2.1 雪旺细胞的培养及纯化 无菌条件下分离SD大鼠臂丛神经, 用0.25%的胰蛋白酶消化, 用胎牛血清中止消化,离心以后加入DMEM/F12培养液培养。3～5 d后对细胞应用免疫磁珠阳性分选方法进行纯化, 培养2 d后进行传代接种,培养过程中对提纯后的大鼠臂丛神经雪旺细胞进行形态学观察、并绘制其生长曲线, 采用细胞免疫荧光染色对细胞进行S-100免疫荧光鉴定并且计算细胞纯度。

1.2.2 七厘散含药血清的制备 七厘散灌胃液按照0.15 g/1.5 ml配置, 每天每只大鼠灌胃2次, 间隔12 h, 连续灌胃, 取血当日早晨在灌胃, 最后麻醉大鼠开腹, 取血清混合液, 离心后过滤除菌, 以存备用。

1.2.3 不同干预分组 雪旺细胞经过贴壁培养及鉴定后P3代细胞接种于器皿中, 加入七厘散进行干预, 含量5%［3］, 设为实验组；对照组加入等量生理盐水。采用S-100免疫荧光法鉴定雪旺细胞及纯度, 流式细胞仪检测细胞活力及增值情况。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 雪旺细胞的贴壁培养及鉴定 雪旺细胞经S-100免疫荧光标记染色提示阳性细胞率达90%以上, 纯化后的大鼠臂丛雪旺细胞纯度为(97.5±1.3)%。5%七厘散含药血清可以促进雪旺细胞增殖。

2.2 含药血清干预后细胞活力 细胞计数显示, 实验组倍增时间为6 d, 明显优于对照组的8 d。且实验组A490值为(0.385±0.037), 高于对照组的(0.347±0.045), 差异有统计学意义 (P＜0.05)。

3 讨论

臂丛神经损伤是一种致残性的疾病, 主要表现以肩胛带肌为主的疼痛、无力和肌萎缩, 且预后较差。是一种很严重的神经性疾病, 对患者的影响也特别严重。因此, 对于臂丛神经损伤患者的有效治疗成为了一个急需解决的问题［4］。

雪旺细胞是一种神经纤维层的外膜, 具有可以增加神经元的存活率、促进细胞轴突生长和提高神经元再生的能力,保护正常神经传导性的作用。因此, 雪旺细胞是周围神经再生和周围神经组织工程研究的重要细胞, 不仅为神经修复提供支撑, 尚可诱导神经纤维生长的方向［5］。如果能够找到一种新的药物, 能够提高雪旺细胞的生物学活性, 将会对周围神经的修复与再生, 人工神经的创建, 临床上臂丛神经损伤的治疗巨大的帮助。

七厘散是《良方集腋》中的方剂, 是治疗跌打损伤的名药,临床用于治疗疾病甚多。有研究显示, 七厘散含药血清显著促进外源性骨髓间充质干细胞增殖及促进骨髓间充质干细胞成骨性分化, 表现在该组的碱性磷酸酶活性、骨钙素、I型胶原、钙盐沉积量和钙化结节数高［3］。也有研究显示超微粉碎七厘散对急性血瘀大鼠的活血化瘀作用和垂体后叶素(Pit)诱发大鼠心肌缺血损伤的保护作用增强, 可降低其给药剂量［6］。本研究试想通过中药七厘散对雪旺细胞增殖分化的影响, 进一步探索其治疗周围神经的损伤作用, 实验结果表明七厘散在适当浓度范围内可以促进雪旺细胞的增殖,从而为促进活体神经损伤的修复提供了一些研究基础。应用中药治疗周围神经的损伤在临床上确有积极的疗效。

［1］ 甄雪克, 梁剑峰, 杨文强, 等.丹红注射液对雪旺细胞中BDNF表达的促进作用研究.中华神经医学杂志, 2014,13(6):571-575.

［2］ 刘爱军, 陈杏晔.七厘散含药血清对乳鼠毛囊成纤维细胞增殖的影响.陕西中医, 2014, 35(3):375-377.

［3］ 谢兴文, 徐世红, 李宁, 等.七厘散含药血清对骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化的影响.中国骨质疏松杂志, 2012, 18(10):895-899.

［4］ 张柱基, 庞瑞明, 潘海文, 等.七厘散穴位贴敷对髋膝关节置换术后深静脉血栓形成的防治.陕西中医, 2016,37(12):1605-1607.

［5］ 李晓涛, 李长德, 解云川, 等.神经干细胞与雪旺细胞共移植对大鼠臂丛神经根性撕脱伤的疗效.中国老年学杂志, 2014,33(4):974-975.

［6］ 赵国巍, 梁新丽, 王春柳, 等.超微粉碎七厘散对大鼠急性血瘀血液流变学及心肌缺血损伤保护作用的影响.中华中医药杂志, 2015, 30(1):299-301.