PCR诊断技术用于奶牛乳房炎病原菌快速检测的研究进展

王 丹，杨 峰，李新圃，罗金印，张 哲，刘龙海，张亚茹，张莉莉，李宏胜（.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，兰州 730050；．兰州大学公共卫生学院，兰州 730000）

综述与专论

PCR诊断技术用于奶牛乳房炎病原菌快速检测的研究进展

王 丹1，杨 峰1，李新圃1，罗金印1，张 哲1，刘龙海1，张亚茹1，张莉莉2，李宏胜1
（1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，兰州 730050；2．兰州大学公共卫生学院，兰州 730000）

奶牛乳房炎是一种严重影响奶牛业发展的常见多发病，不仅给乳品业造成巨大的经济损失，而且还影响乳品质量，危及人类健康。目前，对于奶牛乳房炎的治疗大部分奶牛场基本都是在不明确病原菌的情况下滥用抗生素，造成病原菌耐药性增加，治疗效果下降。为了有效治疗奶牛乳房炎，对奶牛乳房炎病原菌的早期快速诊断至关重要。由于传统的乳房炎病原菌的检测方法存在操作繁琐、耗时长、灵敏度低及无法检测抗生素乳样中病原菌等缺陷，因此，临床上急需一种快速、灵敏、简便的检测方法。作者对目前用于奶牛乳房炎病原菌诊断的普通PCR法、多重PCR法、实时荧光定量PCR法、巢氏PCR诊断法以及PCR检测试剂盒等进行了综述，并分析了这些方法的优缺点，同时对未来奶牛乳房炎病原菌诊断的研究方向和前景进行了展望，以期为进一步开发快速、特异、敏感的奶牛乳房炎病原菌诊断技术提供理论参考。

PCR；奶牛；乳房炎；病原菌

奶牛乳房炎是影响世界奶牛业发展，给乳品业造成巨大经济损失的一种常见多发病。是一种由病原微生物感染而引起乳房组织及乳头炎症的一种疾病［1］。目前，对于奶牛乳房炎病原菌的检测，传统的微生物培养及生化鉴定仍然是使用最广的一种方法，但由于该方法操作繁琐，耗时长，对操作者的要求高，不能满足早诊断、早治疗的目标，而且经抗生素治疗后的乳样，容易出现假阴性的结果［2］。因此，为了提高奶牛乳房炎的治疗效果，急需一种快速、灵敏、简便的检测方法。当前，随着分子生物学技术的快速发展，PCR技术在检测病原菌方面得到广泛应用，并展现出良好的应用前景［3］。与传统的微生物法相比，PCR诊断法具有样品不用培养、检测时间短、灵敏度高、费用低、检测病原菌范围广、不受抗生素治疗影响等优点［4］。本文对目前用于奶牛乳房炎主要病原菌的普通PCR诊断法、多重PCR诊断法、实时荧光定量PCR诊断法和巢氏PCR诊断法等进行了综述，以期为进一步开发快速、特异、敏感的奶牛乳房炎病原菌PCR诊断技术提供一定的帮助。

1 普通PCR诊断法

自从1983年Mullis等发明了聚合酶链式反应（PCR）之后，该技术在检测致病菌方面得以广泛应用，尤其是在诊断奶牛乳房炎的过程中展现出其快速、灵敏、特异的优势，并逐步建立起了相对成熟的PCR乳房炎分子诊断方法。在实际应用中，国内外研究者也取得了诸多成效。Forsman等［5］利用16S～23S rRNA基因分别建立了检测葡萄球菌和链球菌的PCR诊断体系，发现16S～23S rRNA间隔区具有较高的保守性，用这一区域设计引物具有较高的特异性［6］。Riyaz-UI-Hassan等［7］利用PCR诊断法快速诊断伤寒沙门氏菌引起的乳房炎。Higuchi等［8］用PCR法成功诊断了牛支原体。布日额等［9］运用牛表面免疫相关蛋白基因（SIP），建立了快速诊断牛乳中的无乳链球菌。贺生中等［10］则以无乳链球菌特异性STRA-AgI-23-ID基因序列为模板，设计了一对引物，快速检测奶牛乳房炎样品中的无乳链球菌。普通PCR检测与传统检测相比虽然有一定的优势，但是普通PCR检测是一种引物扩增一个特定的核酸序列，只能检测一种病原菌，但实际中，引发奶牛乳房炎的病原菌的种类繁多，普通PCR法则不能满足同时检测多个病原菌的要求。

2 多重PCR诊断法

多重PCR检测法克服了普通PCR引物单一的缺陷，是在其基础上改进而来的。多重PCR是在同一PCR反应体系中加入2对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与普通PCR相同，但能够用于多种病原微生物的同时检测或鉴定。2001年，Riffon［11］率先建立了一个多重PCR体系，实现了同时检测引起奶牛乳房炎的4种主要病原菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌和停乳链球菌）。之后，在2002年，印度研究者Ramesh［12］建立了双重PCR体系，能直接从乳房炎样品中同时检测金黄色葡萄球菌和结肠炎耶尔森杆菌，且这两种病原菌的检测下限分别可以达到10 cfu/mL和103cfu/mL。国内也有许多研究者将多重PCR用于奶牛乳房炎的诊断。谢志勤等［13］和肖颖等［14］也先后用三重PCR体系实现了对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌的鉴定。陈玉霞等［15］建立了同时诊断金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌的三重PCR体系，且这3种病原菌的检测灵敏度分别为1×106、1×106和1×103cfu/mL。在2010年，高健等［16］基于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌和停乳链球菌的16S～23S rRNA基因，建立了多重PCR体系，并通过对其优化，几种病原菌的检测灵敏度均达到3×102～103cfu/mL。除了对奶牛乳房炎最主要致病菌（金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、大肠杆菌）的检测外，李栋梁等［17］分别基于16S rDNA保守序列区间设计了5对引物，建立了用于诊断产气荚膜梭菌、乳酸乳球菌、变形杆菌、绿脓杆菌和肠杆菌的多重PCR体系。多重PCR的应用使奶牛乳房炎的诊断更为快捷、简便，是PCR临床应用研究中颇具吸引力的诊断技术。

3 实时荧光定量PCR诊断法

随着科学技术的不断发展，PCR迎来了飞跃式发展，实时荧光定量PCR诊断法（Real-time PCR）就是最显著的体现。Real-time PCR利用荧光信号监测整个PCR扩增过程，通过建立标准曲线对未知模板进行定量分析。相对传统的PCR诊断法，Real-time PCR技术检测的灵敏度不仅大大提升，而且还能够明确地检测出乳房炎样品中含有的细菌数量，实现了PCR技术从定性到定量的飞跃。Graber等［18］以nuc为目的基因，应用Real-time PCR技术检测乳房炎源性的金黄色葡萄球菌，且检测敏感性为1.15×103cfu/mL。瑞士研究者Rossetti等［19］通过设计杂交探针建立了Real-time PCR的诊断方法，成功检测了牛支原体。邢建明等［20］以金黄色femB基因作为靶序列，应用TaqMan探针技术建立了Real-time PCR方法，快速、准确、特异性的定量检测乳房炎样品中的金黄色葡萄球菌。由于金黄色葡萄球菌femB基因是高度保守的特异性标记基因，故该诊断法能够准确地将金黄色葡萄球菌与其同源性较高的葡萄球菌区分开。

4 巢氏PCR诊断法

巢氏PCR过程中要进行两轮的反应，设计两对引物，第1对可以扩增一个大片段，第2对引物扩增位于大片段中的小片段，所以称为巢氏PCR。早在2005年贾玉萍等［21］就用巢氏PCR方法检测无乳链球菌16S rRNA，检测的灵敏度可达到1cfu/mL。史秋梅等［22］利用链球菌属16S rRNA基因的保守区内的可变区设计无乳链球菌特异引物，建立了奶牛乳房炎无乳链球菌的巢氏PCR检测方法，检测结果与生化鉴定结果的符合率达100%。

4 PCR检测试剂盒

PCR法作为一项应用前景很广的检测技术手段，集成统一标准的试剂盒从而大批量地应用于临床的快速诊断成为迫切需求。目前，国内外许多研究者以PCR检测法为基础，研发出适用于临床快速诊断的商品化试剂盒。Zhou等［23］研发出奶牛中安氏隐孢子病原PCR检测试剂盒，该试剂盒具有较高的特异性和灵敏性。2009年，研究者又开发了一个针对多种乳房炎病原菌的Real-time PCR诊断试剂盒，可以同时检测出金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、乳酸球菌、粪肠球菌、克雷伯氏菌、牛棒状杆菌等23种病原菌［24-25］。陈亚明［26］研发了一种四重PCR快速诊断试剂盒，能同时检测出金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌及蜡样芽胞杆菌。王旭荣等［27］研发了一种无乳链球菌快速分离诊断试剂盒，可以降低分离无乳链球菌的成本和时间。

5 存在的问题和应用前景

随着分子生物学技术的快速发展，PCR诊断技术在奶牛乳房炎病原菌检测中也取得了可喜的进展，但不同类型的PCR诊断法均存在一些问题。普通PCR诊断法尽管灵敏度较高，特异性较强，但是一次只能诊断一种病原菌，难以实现对多种病原菌感染进行检测。多重PCR诊断技术虽然克服了普通PCR诊断法一次只能诊断一种病原菌的缺陷，实现了在较大范围内同时检测出多种病原菌，但相对于普通PCR，其灵敏度下降明显，因此需对整个PCR反应体系（包括引物浓度、Taq酶浓度、退火温度及延伸时间等）进行全面的优化。同时如何排除PCR抑制物，并有效提取病原菌的DNA也给技术开发者带来了一定挑战。此外，与普通PCR诊断法相同，多重PCR诊断法也只能对病原菌进行定性检测，而不能定量地显示出细菌的数量。Real-time PCR技术与前两者相比较，在提升灵敏度的同时，也可以显示出乳房炎样品中的病原菌数量，具有较明显的优势。但是，Real-time PCR成本较高，且各实验室无统一标准，限制了其在基层牛场或兽医站的推广应用。巢氏PCR有2次PCR扩增，大大降低了扩增多个靶位点的可能性，增加了检测的特异性、提高了检测的灵敏度，但是该技术在第一轮扩增结束后需要打开PCR管盖添加第2对引物，增加了反应体系被污染的可能。商业化PCR检测试剂盒虽然能够大批量地应用于临床的快速诊断，但使用过程中的反复冻融能够影响酶、引物、模板的活性和结构的稳定性。因此，PCR检测试剂盒在保存过程中的重复性和稳定性成为试剂盒研发的技术难题。

虽然PCR诊断法在奶牛乳房炎的诊断中存在着一系列的问题，但由于该方法具有检出率高、快速、准确等优点，迎合了早发现、早治疗的理念，因此，该方法在奶牛乳房炎诊断上已呈现出广阔的前景。随着研究水平的不断深入，研究技术与方法的不断完善，一定能研发出更完善的、实用性更强的分子生物学诊断方法，从而对乳房炎疾病做出快速、准确的判断，创造出巨大的经济效益和社会效益。

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Research Progress in PCR Diagnosis Technology of Bovine Mastitis Pathogens

WangDan，Yang Feng，Li Hongsheng，et al
（Lanzhou Institute ofAnimal Husbandry and Pharmaceutical Sciences of Chinese Academy ofAgricultural Sciences；Key Laboratory ofVeterinary Pharmaceutical Discovery，Ministry ofAgriculture；Key Laboratory ofNewAnimal Drug Project ofGansu Province，Lanzhou 730050，China）

Dairy cowmastitis is a common disease affecting the development of dairy industry. It causes serious economic loss to dairy farming，and affects the yield and quality of milk，endangers human health.At present，the antibiotics were abused in the treatments of dairy cowmastitis with unclearing pathogens caused，resulting in increasement of pathogen resistance and decreasement of the treatment effects.There are a few shortcomings in traditional detection method for mastitis pathogen dignosis，such as complicated operation，time- consuming，lowsensitivity and no effect on pathogens in milk samples of antibiotics，so that a rapid，sensitive and simple detection method is urgently needed.The rapid diagnosis of mastitis are crucial for the effectively treatment of the dairy cowmastitis. In order to provide theoretical basis for developing rapid，specific and sensitive diagnosis of dairy cow mastitis pathogens，the author summarized the traditional PCR，multiplex PCR，real time PCR，nested PCR and detection kit etc，and analyzed the advantages and disadvantages of these methods.

PCR；cow；mastitis；pathogenic bacteria

S858.23

A

2095-3887（2017）01-0047-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.01.015

2016-11-14

“十二五”国家科技支撑计划（2012BAD12B03）；甘肃省科技支撑计划（144NKCA240）；甘肃省农业科技创新项目（GNCX-2013-59）；中国农业科学院奶牛疾病研究创新工程项目（CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-03）

王丹（1991-），女，硕士研究生。

李宏胜（1964-），男，研究员，博士。研究方向：奶牛乳房炎免疫及预防。