凋亡在糖皮质激素性骨质疏松症中的研究进展

丁香莹 梁敏

1．广西医科大学第一附属医院，广西 南宁530021

2．广西医科大学第一附属医院内分泌科，广西南宁530021

糖皮质激素(glucocorticoid，GC)是临床最常用的药物之一，由于具有良好的抗炎、抗毒、抗休克和免疫抑制作用，广泛用于风湿性疾病、呼吸系统疾病、皮肤病及肾脏病等疾病的治疗［1］。然而长期应用GC会导致许多并发症，包括骨质疏松症、骨坏死、代谢综合症、心血管疾病、感染、白内障等［2］，其中所导致的骨质疏松症，称之为糖皮质激素性骨质疏松 症 (glucocorticoid-induced Osteoporosis，GIOP)［3］，是GC最严重的并发症之一。GIOP是20～45岁人群骨质疏松症最常见的原因。GC治疗数星期后即开始出现骨量丢失，在最初的3个月内骨量丢失速度最快，之后为持续的骨量丢失，1年后骨量丢失速度减慢。在国外一项大样本的人群调查中发现平均0.75%的人长期口服 GC治疗［4］，超过40%的使用GC的人群发生了骨量丢失［5］。GIOP的发生与激素的剂量密切相关，大剂量和长时间的激素治疗更容易出现骨质疏松和骨折。但是，即使使用小剂量的GC也会出现GIOP。如每日服用2.5 mg强的松也可能发生椎骨和髋关节骨质疏松性骨折［6，7］。GIOP引起的骨折严重影响生活质量，致残率和致死率高。因此，目前GIOP已成为全世界面临的严峻公共卫生问题，危害巨大［8］。

1 细胞凋亡的特点与检测

细胞凋亡是细胞生理性的死亡，凋亡对组织内环境的稳定起着重要的作用。1972年，Kerr等［9］首次提出了“细胞凋亡(apoptosis)”的概念，细胞凋亡具有独特的形态学和生化特征，包括细胞收缩、细胞膜外渗、染色质浓缩、细胞核DNA降解［10］。凋亡的异常与许多的疾病密切相关［11］，如癌症、老年性痴呆［12］等。目前有多种检测细胞凋亡的方法，随着细胞凋亡研究的深入，新的检测方法也被不断地开发出来。

1.1 形态学检测方法

1.1.1 普通光学显微镜和电子显微镜:光镜下可以识别细胞凋亡过程中发生的形态变化。采用普通倒置光学显微镜观察细胞凋亡是一个较为快速和廉价的方法，但检测缺乏客观性，只能观察到大体形态结构变化，较难与细胞坏死区分开来。电子显微镜分透射电镜和扫描电镜两种。一般采用透射电镜观察细胞凋亡，透射电镜是观察细胞凋亡最经典和最可靠的方法［13］。采用电子显微镜观察细胞凋亡可以提供足量的信息，对后续生化或分子研究有一定的帮助。但是标本的制作需要耗费较长的时间(透射电镜需5～6 d，扫描电镜需要24 h)，透射电镜分析只能对细胞凋亡进行定性，对细胞凋亡程度的定量分析困难。

1.1.2 荧光显微镜:在荧光显微镜下凋亡细胞核的特征性形态可被清晰地辨认，正常细胞的细胞核染色质呈现的是黄绿色荧光并且分布均匀，细胞胞质呈现橘红色荧光，而凋亡细胞的细胞核染色质染色呈黄绿色荧光且浓聚在核膜内侧。荧光显微镜技术是良好的凋亡检测手段，但是对于细胞凋亡的早期，荧光显微镜很难分辨。

1.2 流式细胞术

1.2.1 Annexin V-FITC/PI双染法:细胞凋亡的最早迹象之一是细胞膜的磷脂酰丝氨酸从质膜的内部转移到细胞膜的外层［14］。膜联蛋白V以钙依赖性的方式结合这些暴露于膜外磷脂酰丝氨酸，它通常与重要的染料一起使用，例如与核酸结合的7氨基放线菌素D(7-amino-actinomysin D，7-ADD)或碘化丙啶(propidium lodide，PI)，但PI只有当膜完整性被破坏时才能渗透到质膜，如在细胞凋亡或坏死的后期阶段。Annexin V-FITC/PI双染法可用于细胞凋亡的早期检测，也可用于细胞凋亡的定量和定性研究。但干扰因素多，尤其在处理细胞的过程中很容易产生假阳性和假阴性结果。

1.2.2 线粒体膜电位的检测:线粒体是细胞中产生ATP的主要场所，在凋亡发生过程中起关键作用，线粒体膜电位变化发生在核酸酶激活和明显的形态变化之前。线粒体膜电位的下降被认为是细胞凋亡过程中最早发生的事件，一旦线粒体膜电位发生变化，细胞凋亡将不可逆转［15］。因此通过检测线粒体膜电位变化可以进行细胞凋亡的早期检测。

1.3 DNA片段化的分子生物学检测

在凋亡进行的过程中，DNA降解要早于典型的形态学改变，因此DNA分子水平的检测对发现凋亡有较高的价值。细胞凋亡最明显的生化特点是激活内源性核酸酶，将核染色体的核小体分解形成寡核苷酸片段，大小约180～200bp［14］。主要的检测方法有琼脂糖凝胶电泳法(DNA Ladder)和原位切口末端标记法(TUNEL)。这些方法具有较高的特异性和灵敏度，为细胞凋亡提供了强大的工具和检测手段。

1.3.1 TUNEL法:1992年由Gavrieli首次提出了脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)介导的缺口末端标记(TUNEL)检测方法［16］。TUNEL法是基于细胞凋亡中断裂的DNA链会产生大量的3＇-OH末端，利用脱氧核糖核甘酸末端转移酶(TdT)将标记的dUTP连接到3＇-OH末端［17］。因为正常细胞几乎没有DNA断裂，没有 3＇-0H 末端产生，故很少染色，因此TUNEL法具有极高的灵敏度，可用于单个细胞的检测;还可以进行定量分析，被广泛应用于组织切片中。但是TUNEL方法缺乏专一性。

1.3.2 DNA Ladder法:细胞凋亡启动时激活核酸内切酶，DNA被分解为180～200 bp整数倍的小片段，在琼脂糖凝胶电泳中表现为梯状条带，这是凋亡特异性结果。正常活细胞DNA条带位于加样孔附近的区带，坏死细胞的DNA由于不规则降解显示出一条连续的膜状条带。采用这种方法快速简便易行，但特异性和敏感性较差，只能进行定性分析［18］。

细胞凋亡的研究需要定性和定量研究，常需要结合多种方法。可根据标本的不同和研究的需要选择不同的研究方法。

2 GC对成骨细胞和骨细胞凋亡的影响

2.1 GIOP与成骨细胞凋亡的关系

对大约42000名男子和妇女的7项队列研究数据进行的Meta分析表明，使用GC会增加任何年龄的腰椎骨折的风险［19］。临床研究［20］发现，GIOP 患者的骨组织中成骨细胞数目减少，成骨细胞的凋亡率增加。动物实验［21］也证实，小鼠服用强的松后，椎骨骨密度降低;组织形态学显示骨小梁面积减少，成骨细胞集落形成单位减少，成骨细胞的凋亡数目增长3倍，干骺端的皮质骨28%的骨细胞发生调亡。提示应用GC后，无论人体和动物发生骨质疏松的风险增加，与成骨细胞发生凋亡有关。

2.2 GC导致成骨细胞凋亡可能的通路

成骨细胞作为GC主要的作用靶点，在GIOP发病中起着重要的作用，GC主要通过与 GC受体(glucocorticoid receptor，GR)结合来发挥生物学作用［22］，研 究［23］发现，GR的拮抗剂米非司酮(RU486)，能够抑制地塞米松导致的细胞凋亡。有研究报道，GC能够增加 BH3-only蛋白Bim的表达［24］以及下调 TIMP-1［25］来促进成骨细胞的凋亡，导致骨质疏松症的发生。在体外实验中，过量的GC能够诱导前凋亡因子Bim和Bak表达，降低存活因子 Bcl-xL 表达［24，26］。过量的 GC 通过促进 Ca2+流出来激活pyk2，活化的pyk2诱导JNK活化，随后引起细胞凋亡［27］。过量的GC增加了活性氧(ROS)的产生，活性氧(ROS)能够通过PKCβ/p66shc/JNK通路诱导细胞凋亡，同时过量的GC抑制了Akt，从而抑制了骨形成和防止细胞凋亡所必需的Wnt/βcatenin通路［28］。Wnt信号通路在成骨细胞生成和骨代谢方面具有重要作用，Wnt信号通路促使成骨细胞分化，抑制成骨细胞和骨细胞的凋亡［29，30］。高剂量的GC抑制Wnt信号通路，引起成骨细胞发生凋亡。在动物实验及体外培养原代C57BL/6细胞中，GC增加了Wnt通路抑制剂(硬化蛋白和Dkk-1)的表达进而促进成骨细胞的凋亡［31］，在沉默Dkk-1表达后能够恢复地塞米松促进成骨细胞分化的作用［32］。

2.3 GC导致成骨细胞凋亡与caspase家族

天门冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶(caspases)是一组在凋亡中发挥重要作用的蛋白酶。caspases在凋亡信号作用下发生逐级水解活化，最后裂解细胞的结构蛋白和功能蛋白，使细胞降解引起凋亡，caspases活化是导致凋亡的中心环节。有研究［33，34］发现 GC 通过激活 caspase-3的活性来诱导成骨细胞凋亡。采用1 μmol/L地塞米松干预成骨细胞系MC3T3-E1细胞，明显增加活化caspase-3的表达［35］。在我们本课题组研究不同浓度地塞米松干预成骨细胞不同时间后成骨发生凋亡相比对照组明显增加，呈现出浓度和时间依赖性，同时也发现caspase-3和caspase-9的基因表达增加，呈现出浓度依赖性和时间依赖性。表明GC导致成骨细胞凋亡与caspase家族密切相关，GC可能是通过激活caspase的活性来诱导成骨细胞凋亡。

2.4 GC导致成骨细胞凋亡的其他靶点

GC还能通过内质网应激促进成骨细胞凋亡，磷酸化的eIF2a能够减轻内质网应激，应用磷酸化的eIF2a能够抑制GC通过内质网应激所致的成骨细胞和骨细胞凋亡的发生［36］。研究发现，地塞米松通过激活转化生长因子β活化激酶1(TAK1)诱导成骨细胞系和骨细胞的凋亡，应用TAK1抑制剂后，能够阻断地塞米松所致的成骨细胞凋亡［37］。

综上所述，成骨细胞是GC作用的主要靶点，GC通过各种机制诱导和促进成骨细胞凋亡，从而导致GIOP的发生。由此可见，细胞凋亡在GIOP的发生发展中发挥了极其重要的作用。

3 糖皮质激素促进细胞凋亡的相关基因

细胞凋亡受到严格的调控，具有十分复杂的分子调控机制，参与的分子和酶也非常多，细胞凋亡的启动和发展需要许多基因及其产物参与。参与GIOP中成骨细胞和骨细胞凋亡的基因主要有B细胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)基因家族、p53基因、Fas和FasL基因等。

3.1 Bcl-2基因家族

Bcl-2基因家族有众多成员，如:Bcl-2、Bcl-x、Bcl-w、Bax、Bak、Bad、Bim、Mcl-1、A1 等。Bcl-2 家族在GIOP中扮演重要的角色［24］，Bcl-2是抗凋亡基因，Bax是促凋亡基因，Bax/Bcl-2的比率的高低决定了细胞凋亡是否发生。用1 mg/kg的地塞米松处理小鼠72 h，TUNEL染色显示小鼠成骨细胞的凋亡率比对照组增加了8倍，实验组成骨细胞的Bcl-2水平下降，Bax水平升高，Bax/Bcl-2比率上升，提示地塞米松通过升高Bax/Bcl-2比率来促进细胞凋亡的发生［38］。

3.2 p53基因

p53基因是一种重要的抑癌基因，调控着细胞生长、分化及死亡各方面。近年来研究［39］表明，p53基因在细胞凋亡的调控中亦有重要作用。研究［35］发现，地塞米松诱导成骨细胞凋亡与p53基因异常激活有关，观察地塞米松对小鼠成骨细胞系的研究发现，细胞周期G1期阻滞和细胞凋亡伴随着p53基因和促凋亡基因Noxa和Puma的表达增加而增加。当p53受到p53 RNA干扰时，地塞米松就不能诱导成骨细胞凋亡和细胞周期阻滞。

3.3 Fas和FasL基因

Fas又称为CD95分子，Fas与其配体Fas L相互作用是引起细胞凋亡的主要途径之一［40］。大多数的组织和细胞都有Fas的表达。Fas L为TNF相关的Ⅱ型膜分子。有研究发现，地塞米松诱导的成骨细胞凋亡可能与Fas/CD95死亡受体有关，应用Fas信号通路的上游caspase-8的抑制剂后，能够阻断地塞米松所致的成骨细胞凋亡［41］。

4 结语

GC是临床上治疗多种疾病的常用药物，其中以地塞米松应用得最为广泛。在采用GC治疗疾病的同时也导致了继发性骨质疏松症的发生。GC主要是通过增加成骨细胞凋亡，引起成骨细胞的数量减少，导致了GIOP的发生。因此对于需要使用GC治疗的患者，可以使用增加骨形成的药物，如特立帕肽来防治GIOP。由于特立帕肽存在价格昂贵，需要每天注射，有增加骨肉瘤发病风险等缺陷，因此，有可能通过开发抑制成骨细胞凋亡的药物来防治GIOP，为临床防治GIOP等代谢性骨病提供更好的手段。