肌肉微环境与骨质疏松

宋敏 刘小钰* 蒋林博 周灵通 董万涛

1．甘肃中医药大学，甘肃 兰州730000

2．甘肃中医药大学附属医院，甘肃兰州730000

当前对于OP的认识已经从不可避免的老龄化后果转变为可以早期预防和治疗的慢性非传染性疾病。目前对OP的研究更多地集中于骨代谢信号通路，而肌肉微环境与OP的相关性研究还未深入展开。中医学认为脾肾亏虚是OP发生的根本，随着人体衰老，脏腑器官机能衰退，气血生化乏源，肌肉筋脉失养，导致肌肉骨骼协调失衡，骨枯髓空，骨肉不相亲，更是强调了肌肉与骨骼的同等重要性。从现代医学角度看，肾虚导致机体免疫功能下降，内分泌系统紊乱，激素调控失衡，从而打破了骨形成与骨吸收的稳态;脾虚则致肌肉微环境遭到破坏，肌肉功能下降，进一步加速了骨质疏松的发生。因此，重视肌肉与骨骼间的平衡制约关系，对于防治OP显得尤为重要。

1 肌肉微环境

肌肉微环境主要包括肌源性干细胞、微循环、信号转导通路以及肌肉收缩产生的机械负荷［1］。对OP的治疗需要从肌肉、骨骼两方面共同干预，一方面需要增加骨密度，提高骨强度;另一方面需要增加肌肉质量，提高肌肉力量。通过相关基础研究，寻找并确定肌肉与骨骼共同的作用靶点，开展针对共同靶点的精准治疗，是当前防治OP所追求的目标。

2 肌肉微环境与OP的相关性

2.1 肌源性干细胞与OP

肌源性干细胞(MDSCs)是经研究发现存在于肌肉中的一类多能干细胞群。长期以来，多项研究发现MDSCs具有体外增殖快、自我更新能力强、免疫特惠、骨骼再生以及多项分化潜能［2］的特点，在特定诱导条件下可以向特定形态特征和功能的不同胚层的细胞进行分化，如成骨细胞(OB)、造血细胞、神经细胞等［3］，能够参与多种组织的损伤修复过程，在基因、组织工程领域具有广泛应用前景。近年来，大量基础研究证实，MDSCs在成骨方面发挥了一定的作用，可用于骨缺损、骨折不愈合、OP等疾病。骨成型蛋白(BMPs)是一种广泛存在于骨基质中的酸性糖蛋白，属于转化生长因子(TGF-β)超家族成员，其中BMP-2是促进骨形成最强的生长因子，能够诱导OB分化。已有研究［4］发现，人MDSCs经BMP-2诱导后，部分细胞胞体肥大并呈圆形改变，且胞体内高表达碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)，说明MDSCs有向OB分化的可能，并且随着BMP-2剂量的增加，ALP、OCN也相应增加。Claros等［5］在MDSCs向成骨及软骨分化的实验中发现，从鼠的骨骼肌获取的MDSCs具有成纤维细胞样形态，同时还可促进OCN、骨涎蛋白、骨桥蛋白等骨形成标志物的表达，且经成骨诱导培养基诱导后，ALP及钙化结节活性增强，MDSCs与脱矿骨基质结合并移植到裸鼠皮下后能明显促进骨形成。大量基础研究表明，Ⅰ型胶原(ColⅠ)作为骨形成标志性生物大分子，MDSCs在向OB分化过程中会促进ColⅠ大量分泌，组织工程学相关研究也证实MDSCs除了在体外特定的条件下可诱导分化为OB，通过相应的载体在体内也可以分化为成骨样细胞。Tamaki等［6］发现在肌肉组织缺损的小鼠体内移植体外扩增的MDSCs后，与对照组相比，肌容量及收缩功能明显提高，而且将MDSCs移植到肾脂肪囊下层，移植部位发现新生的肌组织，证明MDSCs不但可以促进肌肉组织体积和功能的恢复，而且具有向肌组织分化的能力，相关研究［7，8］也进一步证实了这一观点。另有研究［9］发现，MDSCs在促进小鼠骨骼肌肉再生的同时还可以促进周围血管及神经的新生，而肌肉、神经的营养又主要来自于血供。因此，MDSCs在治疗骨骼肌方面疾病的同时可以潜在地促进骨再生。但目前对MDSCs的起源、分离纯化、特异性标志物及其鉴定、诱导分化成骨的具体调控机制等仍未完全阐明，需进一步对MDSCs进行更深入的研究。

2.2 微循环与OP

机体衰老的过程中，脂质过氧化损害加重，微循环发生障碍，血流变异常，细胞新陈代谢紊乱，功能减退，并呈进行性发展，最终导致相应的组织器官功能失常和疾病的发生。肌肉的正常收缩活动需要通过丰富的血供进行能量的充分补给和代谢产物的不断清除。当肌肉局部的微循环与组织需要不相适应时，缺血缺氧、代谢障碍加重、肌肉失养，进而引起组织变性坏死，肌肉萎缩，肌力、肌量及收缩功能下降，骨应力刺激减少，加速骨质流失。对于骨组织而言，微循环障碍致营养物质不能正常通过哈弗氏系统进入骨骼，使得骨骼失养，直接导致骨质疏松。研究表明，老年性OP患者内分泌代谢紊乱的同时血流变也发生了改变，具体表现为红细胞的聚集性和刚性增加，致血液黏度增加，最终导致局部微循环障。Roche等［10］通过动脉灌注硫酸钡的方法发现小鼠双侧卵巢切除术后15 d，胫骨近端干骺端微血管数量明显减少15%。另有实验结果显示，老年小鼠较青壮年小鼠胫骨干骺端H型血管内皮细胞减少，而H型血管内皮细胞又能够介导骨内血管的新生［11，12］。因此，良好的血供不仅维持了肌肉的正常收缩活动，也为骨生长发育提供了必需的营养物质，治疗OP应该重视血液流变性和微循环的改善。

2.3 骨骼肌信号转导通路与OP

骨骼肌是一个动态组织，受外界刺激与自身疾病等多种因素的影响，且与OP的发生紧密相连。研究发现，存在调控骨骼肌与骨代谢的共同信号通路:PI3K-Akt、MAPK 及 NF-κB 信号通路。

2.3.1 PI3K-Akt信号通路:PI3K-Akt-mTORP70S6K是促进蛋白质合成的重要信号通路，由上游的IGF-Ⅰ与其受体结合后被激活，引起骨骼肌肥大，抑制蛋白质降解［13，14］。肌肉收缩产生的机械刺激促进IGF-Ⅰ分泌，与IGF-Ⅰ受体结合致酪氨酸激酶变构并磷酸化胰岛素受体底物Ⅰ，激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，PI3K磷酸化二磷脂酰肌醇为三磷脂酰肌醇，再激活下游蛋白，并建立起丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)细胞膜脂质结合位点。Akt被转位到细胞膜后被相应的蛋白激酶激活，进一步磷酸化一系列底物，包括调节蛋白合成和基因转录细胞增殖蛋白等。激活的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)进而激活下游的靶基因40S核糖体S6蛋白激酶(P70S6K)，最终促进骨骼肌干细胞增殖、肌细胞分化并融合成肌管，促使肌肉生长。mTOR是调节肌肉大小及运动所致骨骼肌重塑的关键基因［15，16］，对于蛋白质翻译起始复合物的形成、核糖体的生成以及多肽链的延伸等过程的正常进行起着重要的作用［17］。P70S6K是mTOR效应子中研究最广泛的蛋白翻译的正调节因子，P70S6K的Thr389磷酸化被认为是机械负荷诱导蛋白增加的标志［18］，并且P70S6K对于肌细胞通过蛋白质合成生长到最佳大小是必需的。用mTOR抑制剂处理C2C12细胞，能够阻断mTOR通路下游靶基因P70S6K的活化，致小鼠骨骼肌生长迟缓，肌核数减少。研究发现，过表达Akt基因，能够增加蛋白合成，最终导致小鼠骨骼肌肥大。另外，Akt被激活后还能抑制糖原合酶激酶3β(GSK3β)活性，通过Akt-GSK3β信号通路增加蛋白质合成，调控肌肉的生长。相关研究也证实，加入GSK3β抑制剂，能够显著增加肌细胞的肥大，与Akt-mTOR-P70S6K信号通路具有协同作用。

PI3K-Akt信号通路在骨代谢中主要负责调控OB的增殖和分化，是正常骨代谢信号转导通路的网络中心，维持正常骨骼发育的动态平衡。当IGF-1激活 PI3K/Akt通路后，下游效应蛋白 mTORC1/S6K1能够促进OB分化，正向调节BMP-2，诱导成人ALP，并抑制OB的凋亡［19］，减缓OP的发生。因此，PI3K-Akt信号通路在调控骨骼肌生长的同时还能促进OB的增殖、分化。Akt基因作为PI3K/Akt信号转导的核心，治疗骨骼与肌肉疾病的共同靶基因，将成为防治OP的新靶点，但具体作用机制需深入研究。

2.3.2Ras-Raf-MAPK/ERK信号通路:MAPK(细胞分裂素活化蛋白激酶)是存在于细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。MAPK信号通路在骨骼肌内主要有3条:ERK1/2、JNK和P38通路。研究［20］表明，骨骼肌氧化应激反应激活此3条信号通路后，能够导致肌肉蛋白分解，肌核凋亡，最终致骨骼肌萎缩。但是，抗氧化系统也会适应性地随之上调。然而骨骼肌氧化应激通路较为复杂，各通路之间交叉作用，机制尚不明朗，还需进一步研究。另有研究［21］表明，ERK1/2、P38 和 JNK-1/2 信号通路之间的相互作用在调控骨骼肌分化、增殖方面也发挥重要作用，激活不同的MAPK通路能够减缓肌肉的破坏，调控能量转换及肌肉收缩蛋白的表达。

在成骨分化与增殖方面，MAPK信号通路占有重要地位，其中Ras-Raf-MAPK/ERK信号途径最为经典。通过酪氨酸蛋白激酶受体和G蛋白偶联受体，由小G蛋白和Ras亚型的结合体磷酸化Raf-1，活化的Raf-1进一步磷酸化下游的MEK1，随后将信号传递给ERK酶促级联反应。ERK1/2激活后转位入细胞核，激活下游调控细胞生长、增殖和分化的相关转录因子(Elk-1、c-Myc、c-Fos、MPKAP-2、MSKs等)。丁道芳等［22］在研究MAPK信号通路与成骨相关的实验中发现，提高MAPK-ERK1/2信号通路的激活程度，成骨相关基因蛋白(ColⅠ、Runx2、ALP)的表达水平也相应提高，抑制此通路后，相应蛋白的表达随之下调，且反应细胞增殖的PCNA蛋白的表达与MAPK-ERK1/2信号通路的激活程度呈正相关。以MAPK信号通路为切入点，寻找共同靶基因，在促进骨生成的同时，又能减缓肌萎缩，是维持骨代谢与骨骼肌平衡的关键所在。

2.3.3 NF-κB信号通路:NF-κB与废用性肌萎缩及慢性疾病导致的骨骼肌萎缩高度相关。通常所指的NF-κB是指具有分布广生物活性高的异源二聚体p50/p65。IKB主要存在于细胞浆中，其成分IKBα是p50/p65主要抑制蛋白，IKB与p50/p65结合成三聚体后掩盖NF-κB的核定位信号区域，抑制其表达。IKK是一种蛋白激酶复合体，当细胞受到外界刺激时，通过经典途径激活IKK复合体，诱导IKB磷酸化，进而使p50/p65从复合物中解离，暴露核定位信号，并转位核中与靶向基因的启动子Foxo结合，进一步诱导MuRF的表达，从而启动泛素蛋白酶体途径加速肌蛋白的降解，导致骨骼肌萎缩。研究发现，MIKK小鼠的MuRF-1升高，而MISR转基因鼠MuRF-1降低，说明NF-κB引起肌肉萎缩的作用机制可能是由MuRF-1上调引起的，抑制IKK/NF-κB/MuRF通路可以抑制小鼠的肌肉萎缩。另外，骨骼肌萎缩还与一些选择性蛋白如肌球重链(MyHC)等的降解表达有关［23-25］，在肌萎缩组织中发现MuRF-1升高能够引起MyHC和肌小节粗肌丝等组分的降解增加。目前，大多学者对NF-κB引起骨骼肌萎缩的可能机理认为是NF-κB可能通过增加泛素连接酶系统中某些蛋白的表达导致骨骼肌发生萎缩。还有部分学者认为可能是NF-κB通过引起某些与炎症相关的小分子的表达从而直接或间接引起肌萎缩，或是NF-κB可能干扰肌生成，使骨骼肌无法再生和修复从而导致的肌萎缩。但是，随着研究的深入，NF-κB信号通路引起骨骼肌萎缩已得到广泛的认同，干预此通路可能成为减缓或治疗肌肉萎缩的重要手段，但其具体机制还需进一步探讨。

大量研究表明NF-κB信号通路在骨重塑中具有重要作用，且通过与其他信号通路间的交叉，影响骨质疏松的发生。核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)是一种分泌型破骨细胞(OC)形成抑制因子，由OB、T细胞及基质细胞产生并表达于这些细胞，与 NF-κB受体活化因子(RANK)结合后激活TNF受体相关因子，最终激活NF-κB信号通路，致NF-κB与IKB分离转移至细胞核内，使破骨基因转录增多，最终诱导OC生成、分化和成熟，并间接抑制成骨相关基因的表达。

临床上不同类型的骨骼肌萎缩都将导致OP的发生，通过干预NF-κB信号通路，抑制肌肉萎缩，抑制OC的形成，不仅能够为研发治疗肌肉萎缩新药物奠定一定的基础，同时也可为防治OP提供多靶点治疗。

2.4 肌肉收缩产生的机械负荷与OP

肌肉和骨骼作为运动系统的两大重要组成部分，相互调节，共同维持骨稳态。骨组织中存在着骨结构力图适应力学环境的调控系统，随着年龄的增长，OP的发生与力学-生物学调控系统机制失衡密切相关。骨结构与骨量主要由肌肉收缩所产生的机械负荷调节，而这种负荷则是作用于骨的最大生物应力，并受力学调控系统的控制。骨的结构发育与其所受外力相适应的过程遵循Wolff定律，附着于骨表面的肌肉收缩产生的机械负荷作用于骨组织内的力学敏感细胞，促进骨形成，抑制骨吸收。当这种机械负荷减弱时，则会引起骨代谢紊乱，骨微结构退化，骨量丢失进行性加重。

2.4.1 机械负荷对OB的影响:OB在维持骨骼生长发育的同时能够应答机械应力刺激从而产生多种生物学效应。研究显示，适当的机械负荷不仅可以刺激小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)的增殖、分化，促进成骨基质矿化，相比之下，与淫羊藿苷联合作用成骨相关信号通路则更能显著增加OPN、OCN、ColⅠ、BMP-2 等蛋白的表达，抑制 NF-κB 的活化［26，27］。Zhong 等［28］通过随机对照试验对 MC3T3-E1进行应力刺激干预，与静置培养组相比，应力刺激能够显著增加Wnt10b及Lrp5的基因表达水平，并且机械加压的效果更为显著。运动医学研究也发现，当人体处于活动状态时，肌肉收缩对骨骼产生的应力能上调Runx2、ALP、及ColⅠ等成骨基因的表达，促进OB的增殖、分化。

2.4.2 机械负荷对OC的影响:OC与OB协同作用，在骨骼发育和形成过程中共同维持骨稳态。骨吸收构成了骨重建的重要功能，体现了骨组织对力学环境的适应能力，随着年龄的增长，肌肉收缩功能的减退，骨骼应力刺激减弱，骨吸收大于骨形成。OPG/RANK/RANKL信号通路主要负责诱导OC的成熟，调控骨吸收。研究表明，机械应力能够通过OPG/RANKL/RANK信号通路直接或间接影响骨代谢，适宜的机械刺激可以上调OB分泌的OPG，通过高亲和力与RANKL结合，防止RANK活化，抑制OC的分化、成熟，相反过度的应力刺激则使OPG/RANKL比例下调，促使OC活跃性增强，并诱导IL-6、IFN等炎性细胞因子倾向骨吸收，进一步加速骨质流失［29，30］。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)和组织蛋白酶-K为OC高分化的标志性酶。Suzuki等［31］对小鼠前破骨细胞进行机械应力干预，运用RT-PCR技术检测到TRAP、组织蛋白酶-K、基质金属蛋白酶9、降钙素受体等mRNA表达下降，而抑制OC分化的诱导型一氧化氮合酶的mRNA表达被上调。上述研究结果进一步证明，机械应力能够通过一定的途径下调骨吸收蛋白基因的表达，进而削弱OC的增殖及分化，抑制骨吸收。

肌肉组织是引起最大动态性骨组织载荷与应变的因素。研究显示，骨应力的大小直接决定骨代谢的方向，肌力对BMD的影响比肌肉含量对BMD的影响更为显著。机械负荷作为提高BMD、维持骨矿物质含量最为有效的刺激，不仅能够改善骨质疏松状况，还可通过增加身体的平衡性和稳定性，降低骨质疏松性骨折的发生率。因此，治疗OP不再只是单纯的通过药物来增加BMD，能否通过特定、有效的运动方式对骨骼肌进行最大效应收缩功能锻炼，从而达到预防OP的目的，也将是运动医学研究领域的一大热点。而且力学-生物学调控系统具体是通过何种途径将力学信号转化为生物学信号、对OB和OC进行调控的机制，还需后续工作者进一步证实。

3 结语

骨骼和肌肉共同组成人体的运动系统，生理上相互协助，病理上相互影响。已证实肌肉微环境在骨质疏松发病中扮演着重要角色。如何维持肌肉微环境的稳态、促进骨形成是目前研究的重点，尤其从骨骼肌信号转导通路以及将力学信号转变为生物学信号的具体途径进行深入研究，寻找兼顾肌肉和骨骼共同的作用靶点，可能成为今后研究OP的新途径。