猪星状病毒2型PCR检测分型方法的建立及初步应用

罗 璋，罗季委，李海锦，贺巨炬，彭 旺，李润成，余兴龙，肖朝庭

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.湖南大学生物学院，湖南长沙410082）

猪星状病毒2型PCR检测分型方法的建立及初步应用

罗 璋1，罗季委1，李海锦1，贺巨炬1，彭 旺1，李润成1，余兴龙1，肖朝庭2※

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.湖南大学生物学院，湖南长沙410082）

根据GenBank登的猪星状病毒2型（PAstV2）序列，设计1对引物。通过优化反应条件，首次在湖南地区检测到PAstV2型病毒。用该方法通过提取样品RNA，采用RT-PCR进行扩增，得到一条预期的特异性条带（243bp），将扩增产物进行测序分析，结果表明该序列与PAstV2型的参考序列同源性为96％。同时，用该引物检测可引起腹泻的PEDV、TGEV、CSFV和PRRSV四种病毒RNA，RT-PCR结果均为阴性。该RT-PCR的敏感性试验结果表明其最高敏感度为400 pg/μL。采用该方法对湖南境内78份猪肠道和粪便样品进行检测，发现PAstV2型的感染率达到11.5％（9/78）。结果表明该方法可以应用于临床PAstV2检测。

猪星状病毒；基因型；PCR；PAstV2

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与病料

猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）由湖南农业大学动物医学院预防兽医实验室保存；猪瘟病毒（CSFV）和猪蓝耳病病毒（PRRSV）来自于普莱科生物疫苗毒；78份猪粪便和肠道收集于湖南不同地区的猪场。

1.1.2 主要试剂

RNA抽提试剂Trizo1Reagent购自Invitrogen公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司；Taq DNA聚合酶Mix购自天恩泽生物有限公司；无R N A酶水购自生工生物工程有限公司，其他常规试剂均为国产，分析纯。

1.1.3 样品处理

取病猪的粪便0.2g，加入1mL无RNA酶水，用旋涡混合仪震荡混匀后，放入高速台式冷冻离心机12 000r/min离心5min，取上清液至-20℃冰箱贮存。

1.1.5 RNA的提取与cDNA的合成

取150μL样品加入1mL Trizo1，震荡摇晃，加入250μL氯仿，静置15min，于4℃12 000r/min离心10min。取上清液加入250μL异丙醇，混匀，于4℃12 000r/min离心6min。弃上清，加入无水乙醇300μL，混匀，于4℃12 000r/min离心3min。弃上清，加入300μL无RNA酶水，溶解RNA。取1μL RNA至PCR管，并加入RNase Free H2O 10μL、5× RT Buffer 4μL、10mM dNTPs 2μL、Random primer 1μL、RNase Inhibitor 1μL、Reverse Transcriptase 1μL，共20μL体系。反应条件：25℃、20min，42℃、45min，72℃、5min，4℃保存备用。

1.1.6 引物设计及合成

根据GenBank上PAstV2(JX556690)基因序列，用Primer5.0软件设计一对特异性引物（表1）。引物由华大基因公司合成。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增条件优化

以PAstV2的cDNA为模板建立PCR反应体系，共18.1μL：Taq DNA聚合酶Mix 8μL，PAstV2 Forward Primer 0.3μL，PAstV2 Reverse Primer 0.3μL，模板1.5μL，双蒸水8μL。改变递减PCR循环中的退火温度：95℃5min；95℃30s,（63℃、61℃、59℃、57℃、55℃）30s，72℃30s（35个循环）；72℃5min 15℃保存。固定扩增效果最佳的退火温度，改变反应体系中引物的比例，最后根据1.2％琼脂糖凝胶电泳效果逐步筛选出最佳退火温度，同时将剩余的PCR扩增产物送华大基因测序。

1.2.2 PCR方法的特异性试验

利用建立的PCR方法分别对PEDV、TGEV、PRRSV、CSFV及PAstV的cDNA进行PCR扩增，同时用ddH2O作为阴性对照检测。

1.2.3 PCR方法的敏感性试验

选取PAstV2型检测为阳性的RNA模板，反转录后用分光光度计测量其cDNA浓度并将其浓度稀释到400ng/μL，再将其浓度分别稀释到40ng/μL、4ng/μL、400pg/μL和40pg/μL，同时设阴性对照，检查该方法的敏感性。

1.2.4 PCR方法的初步应用

利用建立的PCR方法对来自湖南的78份肠道和粪便样品进行检测。

2 结果

2.1 PCR扩增条件优化

筛选出最佳退火温度为57℃。扩增出一条243bp条带，与预期条带相符（图1）。测序结果为：accctatctgatgccacagtgagaccatcctttcaaggaatacattgaaaaatgc cttgccgccctcgagaccgggcgcaccttgcctaaaatcactgatgagcagct ggatcgtctttggaggggaggaccaaagacagcatctaatggctaatcgccagc agaagcgtggtccacgcactacgaccaacatcgtggtgcgcaatggaa。

将测序结果进行B1ast序列比对，发现与猪星状病毒2型参考序列JX556690的同源性为96％。

（N：阴性对照；1、2：PASTV2；M：DL2000DNAMarker）图1 PCR试验扩增结果

2.2 PCR方法的特异性试验结果

利用建立的PCR方法分别对PEDV、TGEV、CSFV及PRRSV的cDNA进行PCR扩增，同时用ddH2O作为阴性对照检测，PCR产物经1.2％琼脂凝胶电泳检测。结果显示，PEDV、TGEV、CSFV、PRRSV及阴性对照没有出现扩增条带，只有PAstV2出现了预期的目的条带（243bp）（图2）。

（N：阴性对照；1：PEDV；2：TGEV；3：CSFV；4：PRRSV；5：PAstV2；M：DL2000DNAMarker）图2 PCR方法特异性试验结果

2.3 PCR方法的敏感试验结果

用优化的PCR方法对PAstV基因2型不同浓度的cDNA进行核算扩增。结果表明，该方法检测PAstV2的最高敏感度在400pg/μL，敏感性良好。（图3）。

N：阴性对照；1：40pg/μL，2：400pg/μL，3：4ng/μL，4：40ng/μL，5：400ng/μL，M：DL2000DNAMarker）图3 PCR敏感性试验结果

2.4 PCR方法的初步应用

用建立的PCR方法对来自湖南的78份肠道和粪便样品进行PASTV检测，结果表明猪群PASTV2型感染率为11.5％（9/78）。

3 结论与讨论

目前我国对猪星状病毒的研究相对较少，湖南省内猪星状病毒报道还是首例，本研究建立的猪星状病毒2型PCR检测分型方法，操作简单，特异性强，敏感性良好。能快速的检测猪星状病毒2型在猪群中的感染率，为PAstV流行病学调查研究提供了简单、快速、准确的检测方法。

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S852.65+9.6

A

1006-4907（2016）02-0039-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2016.02.019

2016-02-18

国家自然科学基金(31372459)。作者简介：罗璋（1990～），男，在读研究生，研究方向：病原分子生物学。

※通讯作者：肖朝庭，E-mai1：xiaocht@126.com。