PRV定量PCR检测方法的建立及其在猪精液检测中的初步应用

聂 昂，王婕敏，张居作，蔡文杰，袁安文※，薛立群※

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.湖南省畜牧兽医研究所，湖南长沙410131）

PRV定量PCR检测方法的建立及其在猪精液检测中的初步应用

聂 昂1，王婕敏1，张居作1，蔡文杰2，袁安文1※，薛立群1※

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.湖南省畜牧兽医研究所，湖南长沙410131）

文章根据PRV基因序列，设计特异性引物扩增gH基因，构建重组质粒；优化实验条件，建立PRV SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果表明该方法的标准曲线线性关系良好，R 2=0.998，E=103.854％；特异性强，检测猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环2型病毒、猪乙脑病毒和猪瘟兔化弱毒疫苗等均无扩增曲线；灵敏度高，最低可检测到的27.9拷贝；在公猪精液中最低可检测到病毒量为16TCID50/100μL，可重复验证，变异系数均低于3.5％；利用该方法对湖南省109份公猪精液样品进行了检测，发现20份阳性样品，阳性率为18.35％，比国标普通PCR法检出率高。该方法的建立将为PRV的流行病学调查提供可靠的技术支持。

PRV；荧光定量PCR；公猪精液；流行病学

猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)又称猪疱疹病毒Ⅰ型，是危害养猪业的主要病原之一，主要引起仔猪死亡，母猪繁殖障碍（早产，流产，死胎，木乃伊胎）；而成年猪多为潜伏感染[1]。猪伪狂犬病毒可以在猪群中水平传播，也能够通过公猪精液垂直传播[2,3]。随着人工授精技术在养猪业的推广使用，病毒在猪群中的广泛传播的风险增加。为了掌握公猪精液中携带伪狂犬病毒的情况，有必要建立一种能够在公猪精液中检测出猪伪狂犬病毒的方法。荧光定量PCR技术是在普通PCR技术上发展起来的一种新的检测技术。具有操作简单快速、重复性好、特异性强、灵敏度高，可以准确定量检测，能够有效检出早期感染和潜伏感染病毒的特点，现已在动物疫病检测上广泛应用[4]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和疫苗

猪伪狂犬病毒(PRV)分离株和猪细小病毒(PPV)分离株由湖南农业大学动物医学院临床分子实验室保存；猪圆环病毒2型(PCV2)毒株由湖南农业大学动物医学院功能蛋白组学实验中心馈赠，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，猪瘟病毒(CSFV)和猪乙型脑炎病毒(JEV)均为疫苗株。

1.1.2 主要试剂和仪器

1.1.3 公猪精液样品

公猪精液样品于2015年～2016年间采自湖南省内15个猪场和人工授精站的公猪精液样品共计109份，其中包括8个散养户猪场的34份精液；5个规模化猪场的68份精液；2个人工授精站的7份精液。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计

比对GenBank中的多株PRV病毒gH基因序列，选取保守序列，参照PRV毒株（GenBank：NC_006151. 1）的gH基因，应用PrimerPremier5.0生物软件设计了上游引物（PRV-F）和下游引物（PRV-R）由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1.2.2 标准品的制备

运用PRV-F和PRV-R引物对提取的PRV DNA模板进行PCR扩增，反应程序为：94℃3min；94℃15s，62℃15s，72℃20s，35个循环；72℃10min。PCR产物1.5％琼脂糖凝胶电泳,切胶回收纯化目的基因片段，与pMD-18T载体连接构建重组质粒，转化进感受态细菌中，经过蓝白斑筛选，确定阳性菌落，大量培养，提取阳性重组质粒。对阳性重组质粒进行PCR验证和Eco I和HindⅢ双酶切验证，对验证正确的阳性重组质粒进行测序鉴定。用Nanodrop2000核酸分析仪对测序正确的重组质粒进行浓度测定，计算拷贝数。

1.2.3 PRV SYBRGreen I荧光定量PCR标准曲线的建立

将PRV重组质粒标准品进行10倍倍比系列稀释，选取各稀释梯度重组质粒作模板进行荧光定量PCR反应；其20μL体系为：SYBR Premix ExTaq (2×)20μL；PRV-F（20μM）和PRV-R（20μM）各0.2μL；ROX Reference Dye(50×)0.4μL；DNA模板2μL；ddH2O 7.2μL。反应程序为：95℃1min；95℃5s，62℃30s，共40个循环。溶解曲线反应程序为：95℃15s,60℃1min，95℃15s。进行数据分析，确定标准曲线。

1.2.4 PRVSYBRGreen I荧光定量PCR的特异性实验

用PCV2、PRV、PPV的DNA，PRRSV、CSFV及JEV的cDNA作为模板，同时设立空白对照，每个样品3个复孔，用建立的PRV SYBRGreen I荧光定量PCR方法进行检测。用以检测其特异性。

1.2.5 PRVSYBRGreen I荧光定量PCR的敏感性实验

将已测浓度的PRV阳性重组质粒进行10倍梯度系列稀释，用所建立的荧光定量PCR方法进行检测，得出所构建方法的重组质粒模板的最低检出拷贝数。同时选取PRV病毒液（105.405TCID50/100μL）经PBS 5倍梯度系列稀释，将各稀释度PRV病毒液混入阴性公猪精液中，提取DNA作模板，进行荧光定量PCR检测，测定该方法在精液中的最低检出病毒量。同时进行国标（GB/T 18641-2002）常规PCR[5]检测，对比两种方法的灵敏度。

1.2.6 PRVSYBRGreen I荧光定量PCR的重复性实验

选取浓度为2.79×106copies/μL、2.79×105copies/μL、2.79×104copies/μL的阳性重组质粒稀释品和选取混入PRV病毒50819 TCID50/100μ L、407 TCID50/100μL、16 TCID50/100μL的精液样品，用建立的PRV SYBRGreen I rea1-time PCR进行3次批内重复试验和3次批间重复试验，实验结束后对扩增曲线及Ct值进行分析。

1.2.7 临床样品检测

对湖南省内15个猪场和人工授精站采集的109份公猪精液样品，应用构建的PRV SYBRGreen Irea1-time PCR方法进行检测，同时根据国家标准GB/T 18641-2002中的检测方法[5]进行常规PCR检测，对比检测结果。

2 结果

2.1 PRV阳性标准品的制备

运用设计的引物经梯度PCR扩增和1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，扩增出与预期大小相符的片段（146 bp），最佳退火温度为62℃。构建的PRV重组质粒送华大测序，测序结果与参考序列进行比对，同源性为100％。用Nanodrop2000核酸分析仪测得PRV重组质粒浓度为86.7ng/μL，计算得出拷贝数为2.79×1010copies/μL。

(M:DL2000DNAMarker;1:52℃;2:54℃;3:56℃;4:58℃;5:60℃;6:62℃)图1 PRV目的基因PCR扩增结果

将制备的标准质粒10倍倍比稀释，选取2.79×1010copies/μL浓度的标准质粒做模板，进行荧光定量PCR反应，根据结果系统绘制出标准曲线，结果显示在2.79×106～2.79×101copies/μL浓度有良好的线性关系，得到的标准曲线较为理想(图2)。标准曲线的相关系数为：R2：0.998；E=103. 854％。PRV的拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式为：Ct=-3.233×1gDNA拷贝数+19.696。进行溶解曲线分析发现溶解峰单一，溶解温度在88.8℃左右。

图2 FQ-PRV荧光定量PCR标准曲线

图3 FQ-PRV荧光定量特异性实验结果

2.2.2 特异性实验

特异性实验结果（图3）表明，PRV有特异性扩增，对照组PPV、PCV2、PRRSV、CSFV、JEV和阴性对照组均无特异性扩增。

2.2.3 敏感性实验

构建的PRV荧光定量PCR方法扩增2.79× 101copies/μL浓度重组质粒模板和在公猪精液中检测到16 TCID50/100μL仍然有S型曲线，低于该浓度不能检测出，表明最低可以检测到2.79×101拷贝数量级（图4）和在公猪精液中最低可以检测到16 TCID50/100μL（图5）。国标普通PCR法[5]检测结果显示在81 TCID50/100μL时仍可见单一明显条带，低于该浓度后出现杂带，结果不能准确判定，说明国标普通PCR法[5]最低可检测到81 TCID50/100μL的病毒含量（图6）。结果表明构建的荧光定量PCR法的灵敏度比国标普通PCR法灵敏度高5倍。

(1～6：2.79×106copies/μL～2.79×101 copies/μL;7.阴性对照)图4 FQ-PRV敏感性实验结果

(1.50819TCID50/100μL;2.10164TCID50/100μL;3.2033TCID50/100μL; 4.407TCID50/100μL;5.81TCID50/100μL;6.16 TCID50/100μL;7.3.3 TCID50/100μL;8.阴性对照)图5 FQ-PCR检测公猪精液中PRV敏感性实验结果

2.2.4 PRV重复性实验

3次批内重复实验和3次批间重复实验结果表明：在重组质粒检测中其批内实验变异系数为0.10％～0.77％，批间实验变异系数为1.88％～2.48％；在带毒精液中批内实验变异系数为0.17％～0.50％，批间实验变异系数为0.50％～3.46％。表明该方法有较高的重复性，保证了检测结果的稳定性与可靠性。

(1.50819TCID50/100μL;2.10164TCID50/100μL;3.2033TCID50/100μL;4. 407 TCID50/100μL;5.81 TCID50/100μL;6.16 TCID50/100μL;7.3.3 TCID50/100μL;8.0.66 TCID50/100μL;+:阳性对照;-:阴性对照;M. DL2000DNAM arker)图6 PCR检测公猪精液中PRV敏感性实验

表1 荧光定量PCR的重复性试验

2.3 临床样品检测结果

采集的109份临床精液样品进行荧光定量PCR和国标GB/T 18641-2002普通PCR法[5]检测。结果表明，国标普通PCR检测出15份阳性样品，检出率13.76％；构建的PRV SYBR Green I rea1-time PCR方法检出20份阳性样品，阳性率18.35％。说明构建的PRV荧光定量PCR方法比国标普通PCR法灵敏度高。

3 讨论

gH基因是伪狂犬病毒复制的必须基因，较为保守[6]。本实验对多株伪狂犬病毒毒株进行了同源性比较，选取gH基因的保守性序列，应用Primer Premier5.0生物软件设计了1对特异性引物。构建的SYBRGreen Irea1-time PCR方法标准曲线线性关系良好，R2=0.998，E=103.854％；特异性强，溶解曲线峰值单一，检测猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环2型病毒、猪乙脑病毒和猪瘟兔化弱毒疫苗等均无扩增曲线；灵敏度高，最低可检测到的27.9拷贝的阳性质粒，在公猪精液中最低可检测到的病毒量为16TCID50/100μL,灵敏度与杨红杰等[7]和李雪明等[8]建立的PRV SYBRGreen I荧光定量PCR方法的检测灵敏度（86拷贝/μL和69拷贝/μL）相当；重复性检测结果良好，批内和批间实验的变异系数均低于3.5％。

PCR技术已被用于检测精液中猪伪狂犬病毒。2006年4月～10月间孙泉云等对上海及其周边地区30个猪场和人工授精站的355份精液进行了检测，结果表明，PRV阳性率为2.54％，且存在PRV和PPV混合感染[9]；黄夏等应用PCR技术对广西6市12个种猪场441份精液进行检测发现，PRV精液样品阳性率为0.45％[10]。2006年黄夏等应用PCR技术对广西11个种猪场235份精液进行检测，PRV阳性率为5.53％[11]，并且发现PRV和PPV、PCV2混合感染严重。2009年冯迎春等对四川各地区猪场76份精液进行了检测，检测结果表明PRV带毒率较高为19.7％[12]。王军一等对2007～2009年山东部分地区727份精液样品进行5种主要病原检测，结果显示PRV阳性率为0.96％[13]。雷湘兰等于2010年～2012年对海南省部分种猪的精液进行调查发现PRV感染率为4.80％[14]。本研究运用构建的荧光定量PCR方法和国标普通PCR法[5]对109份精液样品进行检测，结果发现构建的荧光定量PCR方法检出20份阳性样品，阳性率18.35％。而国标普通PCR法检出15份阳性样品，阳性率为13.76％。结果表明构建的荧光定量PCR检出率比普通PCR要高，有利于种公猪精液中PRV在潜伏感染期和早期感染的检出。

人工授精技术的广泛应用为PRV通过种猪精液传播提供了可能。因此，加强种公猪精液病原生物的监测对于控制疫病的传播有重要意义。本研究构建的PRV SYBRGreen Irea1-time PCR方法具有稳定性强、灵敏度高、特异性好等特点，为检测种公猪精液中PRV感染情况提供了有效的检测手段，有较高的应用价值。

[1]罗满林.动物传染病学[M].北京:中国林业出版社,2013: 78-82.

[2]VAN RIJN P A,WELLENBERG G J,HAKZE-VAN DER HONING R,et al.Detection of economically important viruses in boar semen by quantitative RealTime PCRTMtechnology[J].J. Virol.Methods,2004,120(2):151-160.

[3]GUéRIN B,POZZIN.Viruses in boar semen:detection and clinical aswell as epidemiological consequences regarding disease transmission by artificial insemination[J].Theriogenology. 2005,63(2):556-572.

[4]杨丽莎，薛立群.荧光定量PCR检测技术及其在猪病诊断中的应用[J].湖南畜牧兽医,2014,(2):1-4.

[5]GB/T 18641-2002伪狂犬病诊断技术[S].北京：中国标准出版社,2002.

[6]PEETERSB,DEWIND N,BROER R,et al.Glycoprotein H of pseudorabies virus is essential for entry and cell-to-cell spread of the virus[J].JVirol,1992,66(6):3888-3892.

[7]杨红杰,于长青,林树伯,等.伪狂犬病病毒gB基因荧光定量PCR检测方法的建立[J].北京农学院学报,2015,(3):48-51.

[8]李雪明，于红欣，杨红杰，等.伪狂犬病病毒gE基因荧光定量PCR检测方法的建立[J].北京农学院学报,2015,(4):74-77.

[9]孙泉云,周锦萍,张维谊,等.种公猪精液中与繁殖障碍有关的6种病毒的检测[J].动物医学进展,2007,(11):30-33.

[10]黄夏,陈义祥,覃芳芸,等.公猪精液CSFV、PRRSV、PCV-2、PRV和PPV的PCR检测[J].广西农业科学,2008,(2): 236-239.

[11]黄夏，陈义祥，磨龙春，等.应用PCR方法对广西公猪精液的伪狂犬病、圆环病毒2型和细小病毒混合感染情况的检测[J].广东畜牧兽医科技,2008,(1):41-43.

[12]冯迎春,黄攀,颜其贵.四川省部分猪场公猪精液带毒情况的PCR和RT-PCR检测[J].养猪,2010,(5):71-72.

[13]王军一,金扩世,徐敬龙.山东种公猪精液携带主要病原的检测[J].动物医学进展,2012,(8):108-111.

[14]雷湘兰,马乃祥,沈振国.海南种公猪精液中的病毒调查研究[J].养猪,2012,(4):40.

S852.65

A

1006-4907（2016）02-0031-05

10.3969/j.issn.1006-4907.2016.02.016

2016-03-01

聂昂（1991～），男，临床兽医硕士研究生。

※通讯作者：袁安文（1967～），男，教授，研究方向：动物生殖医学，yuananweng@163.com。

※通讯作者：薛立群（1955～），男，教授，研究方向：动物生殖医学，liqun_xue@aliyun.com。