IHA法和间接ELISA法检测猪附红细胞体抗体结果对比分析

俞鹏，朱珍珍，贾杏林

（1.湖南省常德市畜牧兽医水产局，湖南常德415400；湖南省常德津市市畜牧兽医水产局，湖南常德415400；3.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128）

IHA法和间接ELISA法检测猪附红细胞体抗体结果对比分析

俞鹏1，朱珍珍2，贾杏林3※

（1.湖南省常德市畜牧兽医水产局，湖南常德415400；湖南省常德津市市畜牧兽医水产局，湖南常德415400；3.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128）

为了寻求适用于基层实验室对猪附红细胞体抗体的检测方法，文章试验用间接血凝试验（IHA）和间接ELISA两种方法分别检测了402份临床送检猪血清，并对这两种方法的敏感性和符合率进行比较研究。结果表明，IHA和ELISA法结果符合率为80.1％，且ELISA方法比IHA敏感性更高，更适合批量检测和群体普查。

猪附红细胞体；抗体；间接ELISA;IHA；对比

猪附红细胞体病在世界范围内对所有日龄猪均有危害，常与猪瘟、猪肺疫、猪链球菌病、猪流感等疾病混合感染，病愈后的猪可终生携带病原[1-2]。该病的流行不但对畜牧业造成重大经济损失，而且对人类健康构成威胁，因此，急需一种对猪附红细胞体病准确、快速、简便的检测方法。

一直以来，由于尚无对附红细胞体成熟的体外培养方法，难以获取大量原始抗原，阻碍了血清学检测附红细胞体的发展以及快速诊断试剂盒的研制[3]。湖南农业大学动物医学院李晓云博士[4]改进了猪附红细胞体的培养体系，做到除首次接种外不添加任何红细胞且连续培养达280d以上，染虫率维持近100％。本实验全菌病原均由李晓云老师提供，为实验的顺利完成提供了重要保障，同时也证明了附红细胞体培养的可行性。

目前国内对猪附红细胞体病的检疫常采用传统的染色镜检法，该法敏感度较低。血清学方法最适合群体检测，酶联免疫吸附试验(ELISA)和IHA是临床上较常用的一种血清学检测方法[5]。为了寻求适用于基层实验室对猪附红细胞体病抗体检测方法，将血清学检测方法广泛的应用于临床诊断，本文将进一步探讨两种试验方法的敏感性及特异性。

1 材料及方法

1.1 试验材料

1.1.1 抗原

猪附红细胞体抗原由湖南农业大学动物医学院李晓云博士等人提供。猪附红细胞体用Thermo NANODROP 2000微量分光光度计A260/A280测定蛋白浓度。

1.1.2 猪血清

阴性血清由Gibco公司生产，且IHA检测为阴性;阳性血清由湖南农业大学动物医学院临床兽医学实验室自制;微量分光光度计（型号为Thermo NANODROP 2000）由湖南农业大学动物医学院临床兽医学实验室提供；临床检测样来自湖南省22个猪场。

1.2 方法

1.2.1 阳性血清的制备

将培养抗原依照杨汉春[6]等人的方法免疫家猪（母猪），每周一次，免疫4次。最后一次免疫9天后心脏采血分离血清,间接ELISA法检测抗体效价。间接ELISA效价检测的结果判定:以测定孔OD值(P)/阴性对照孔OD值(N)≥2.1判为阳性,1.5≤P/N≤2.1为可疑,P/N＜1.5为阴性。

1.2.2 间接ELISA

按照本实验室建立的ELISA方法，抗原80ug每孔4℃包被过夜，洗涤3次；用0.5％BSA37℃封闭1小时加4℃封闭一小时，洗涤3次;血清1:40作用1.5小时后洗涤3次;辣根过氧化物酶兔抗猪IgG 1:1000稀释作用为45min后洗涤5次;最后TMB 37℃显色20min。ELISA结果判定如下，当OD450≥0.228时判为阳性；当OD450＜0.162时判为阴性；当0.162≤OD450＜0.195时判为可疑。

1.2.3 间接血凝实验(IHA)

在96孔微量板中每孔加入25μL稀释液；将待检血清25μL加入第1孔混匀后倍比稀释至12孔，最后1孔弃去25μL。此时1排的1～12孔待测血清的稀释度依次为：1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1: 64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048、1:4096。2号待检血清加入第2排；取3号血清加入第3排,均按上方法稀释；在微量板的第7排加阴性性血清25μL倍比稀释到第4孔。第5～6孔为稀释液对照。在第8排的第1孔加阳性血清25μL并倍比稀释到第12孔掉。被检血清各孔、阴性对照各孔、阳性对照各孔、稀释液对照孔均加入致敏红细胞25 μL。加样完毕，于微型振荡器上振荡3～5min，并将血凝板放于有湿纱布的搪瓷盘内，置37℃恒温箱中40～60min,取出观察结果，必要时放室温下过夜，做终判。IHA试验判定标准为小于或等于1:8判为阴性，大于1:8判为阳性。

1.2.4 敏感性试验

分别用IHA和ELISA同时检测8份猪阳性血清，比较两种方法的敏感性。

1.2.5 临床样品检测及符合率试验

用IHA和ELISA方法分别检测湖南22个猪场402份送检血清，比较二者的灵敏度及符合率。

2 结果

2.1 敏感性试验

取8份猪血清，倍比稀释后分别用IHA和ELISA方法检测。结果表明，ELISA方法的敏感性比IHA高5倍左右。

表1 I HA法和间接EL I SA法敏感性结果比较

2.2 符合率试验

从表2可知，用IHA和ELISA方法同时检测临床送检猪血清402份，IHA和ELISA的阳性率分别为53.73％、57.21％。

从表3可知，相对IHA法检测，间接ELISA法检测阳性（a）为187份，阴性(d)135份，假阳性（c）为29份。间接ELISA法检测灵敏度=a/(a+c)×100％ =86.6％;特异度=d/(b+d)×100％=72.6％;漏检率=c/ (a+c)×100％=13.4％;误诊率=b/(b+d)×100％=27. 4％;诊断符合率=（a+d）/(a+b+c+d)×100％=80.1％。

表2 两种方法检测猪附红细胞体抗体结果

表3 间接血凝抑制法和间接E L I S A法符合率试验结果

3 讨论

ELISA与IHA方法比较结果可知，IHA和ELISA的阳性率分别为53.73％、57.21％，两者总符合率为80.15。ELISA比IHA的敏感度更高，并且具有快速、灵敏、操作更加简便等优点，可最大限度的避免试验过程中各种因素对结果的影响并减轻实验室人员的工作强度。另外也可用于检测单个样本，特别适用于基层防疫员和规模户，大大方便的畜病的快速诊断，有效提高了该病的检出率。

参考文献：

[1]王国永,潘耀谦,刘志军.猪附红细胞体检测方法研究概况[J].动物医学进展,2006,27(5):9-12.

[2]Wu J,Yu J,Song C.Porcine eperythrozoonosis in China[J]. Vet.J,2012,193(2):535-8.

[3]张长莹，李玉峰，华荣蓉.猪支原体重组MSGI蛋白间接ELISA检测方法的建立[J].畜牧与兽医,2011,43(2):12-18.

[4]李晓云,贾杏林,石德时,等.猪附红细胞体的体外连续培养[J].畜牧兽医学报,2008,39(8):1142-1146.

[5]戴爱玲,李晓华,杨小燕.间接血凝试验与酶联免疫吸附试验检测猪瘟抗体的比较[C].福建：福建省畜牧兽医学会论文集.2009:122-126.

[6]杨汉春.动物免疫学[M].北京:中国农业大学出版社,2003.

S854.43

A

1006-4907（2016）02-0035-02

10.3969/j.issn.1006-4907.2016.02.017

2016-02-19

※通讯作者：贾杏林。