酸枣仁汤对抑郁模型大鼠海马β-catenin表达影响的实验研究

田旭升，李欣，王珑，张家瑞，郭宏伟*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)



酸枣仁汤对抑郁模型大鼠海马β-catenin表达影响的实验研究

田旭升1，李欣1，王珑2，张家瑞1，郭宏伟1*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：观察酸枣仁汤对抑郁大鼠模型海马β-catenin表达的影响。方法：复制慢性轻度不可预见性应激抑郁大鼠模型，测定其体质量、糖水消耗及行为学得分，采用Western-Blot检测大鼠海马中β-catenin的表达。结果：抑郁模型大鼠体质量增长速度减慢，糖水消耗减少，行为学测试分减少，海马内β-catenin表达减少，酸枣仁汤高剂量组可上调β-catenin的表达。结论：酸枣仁汤可增加β-catenin的表达，减少神经元细胞凋亡，具有抗抑郁作用。

抑郁症；酸枣仁汤；β-catenin

抑郁症现作为一种危害严重的精神疾病之一，具有高发病率、高致残率、易复发、自杀倾向等特点。WHO的全球疾病负担合作研究预测，到2020年抑郁症将成为全球第二位医疗疾患[1]。抑郁症不仅使患者健康受到损害，生活质量下降，而且给家庭，社会造成极大负担，因此抑郁症已成为一个严重的社会和医疗问题。可见，对抑郁症的防治研究迫在眉睫。

中医对抑郁症的认识与研究比较早，在治病方法与研究上积累了丰富的经验[2-5]。中医药多环节，多靶点的药理特点也越来越广泛的应用在抑郁症的防治上[6-7]。酸枣仁汤出自《金匮要略》，具有显著的疗效[8-9]。本实验通过复制大鼠抑郁模型，从而观察酸枣仁汤对抑郁大鼠海马内的β-catenin(β-链蛋白)表达的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物

清洁级健康雄性SD大鼠48只，体质量(180±50)g，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，合格证号：SCXK(黑)2014-0008，大鼠所需的专用饲料，由黑龙江中医药大学动物实验中心所提供，高压灭菌处理实验大鼠所需饲料。

1.2 实验药品及制备

酸枣仁、茯苓、知母、甘草、川芎购于哈尔滨人民同泰药店，经鉴定符合2015年版《中国药典》。酸枣仁汤的剂量参考《金匮要略》原方为依据，按照常规方法煎煮制成水煎剂，浓缩至0.5 g/ml、1.0 g/ml、2.0 g/ml，放置于4℃冰箱保存备用。生理盐水、氟西汀购于哈尔滨人民同泰药店;兔抗多克隆二抗PV6001、DAB显色剂购于北京中山公司;其他试剂为国产分析纯。

1.3 实验器材

上海恒电热恒温箱、恒温冰箱(日本三洋电器有限公司)；低速自动平衡离心机(LDZ-2型)；电击箱(北京医科院药研所)；石蜡切片机莱卡2135型(德国)；美国moticam3000显微摄影成像系统；电子天平(沈阳龙腾电子公司)；医学数码图像分析系统(麦奥迪克厦门公司)。

2 实验方法

2.1 分组及给药

将48只大鼠适应性饲养3天后，根据体质量和open-field评分，随机分成空白组、模型组、氟西汀组、酸枣仁汤低、中、高剂量组，每组8只，于造模7天后，连续灌胃21天。大鼠给药量，按人与大鼠等效剂量关系换算，按照10 ml/kg剂量，空白组和模型组给予0.9%蒸馏水灌胃，氟西汀组给予0.36 mg/ml氟西汀混悬液灌胃，酸枣仁汤低中高剂量组分别给予浓度为0.5 g/ml、1.0 g/ml、2.0 g/ml的酸枣仁汤灌胃，6组均每日灌胃1次。

2.2 抑郁模型复制

空白组每笼饲养8只，实验过程中不接受任何刺激。其余组别的大鼠每笼1只进行孤养，在实验的21天内，进行7种不同的慢性应激，每天1种，相同的应激刺激不连续应用。应激方法根据Banasr[10]方法略微改进，具体包括：禁水12 h，禁食12 h，倾斜鼠笼，热刺激，冰水游泳，潮湿饲养，昼夜颠倒。

2.3 指标测定

2.3.1 体质量测量

于实验的第0，21天测量大鼠体质量，观察并测量各组大鼠体质量所发生的变化，进行统计学分析，分析体质量与抑郁的显著性关系。

2.3.2 糖水消耗试验

此实验利用大鼠对糖水的喜好，反应大鼠内源性快感缺失的程度。于实验的第0，21天开始进行，在进行糖水实验前24 h，对各组大鼠禁食、禁水，将大鼠的饮用水更换成1%浓度的蔗糖水，每瓶150 ml，做好称量计算，12 h后记录所有瓶中蔗糖水量的剩余数值，做差值计算出糖水消耗量，进行统计学处理。

2.3.3 行为学检测

于实验的第0，21天开始进行，于大鼠测量完体质量后进行行为学测试，准备测试装置为长、宽各1 m、高0.8 m的木箱，底部设置为25个16 cm×16 cm的小方格。检测过程中要保证减少额外干扰，例如时间、温度、光照、及环境噪音等的干扰。正式检测前，操作者应熟练掌握检测标准，减少人为误差。计算得分由2人或2人以上的操作者完成，1人负责观察记录计时，1人负责记录大鼠活动得分。计算得分方式是：垂直活动得分为前肢抬起、后肢直立为准，计1分，水平活动得分以大鼠四肢共同处于1个方格内为准，计1分。测量时，首先应将大鼠放置在箱子中心处，统计3 min内大鼠水平活动和垂直活动得分总和。

2.3.4 大鼠海马β-catenin表达检测

于实验第21天，大鼠称量体质量及行为学测试后，快速断头剥离海马，按照100 mg/ml加入200 μl RIPA裂解液，加入蛋白酶抑制剂后匀浆；冰上静止1 h，于4 ℃ 12 000 r/min离心30 min；提取上清液测定总蛋白浓度，置-80 ℃冰箱冻存备用；含25 μg总蛋白样品经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到PVDF膜上；TBST配制5%脱脂奶粉室温封闭1 h加小鼠β-catenin单克隆抗体4 ℃冰箱中孵育过夜；加入羊抗兔二抗，羊抗小鼠二抗室温孵育2 h；孵育完后TBST漂白10 min×3次；将膜用P10-LightHRP化学发光液室温孵育5 min后封入保鲜膜，暗室内压入胶片曝光显影。每次检测时都检测β-actin，以β-catenin与内参β-actin的灰比度进行比较，对显影结果进行扫描，进行统计学分析。

2.4 统计处理

3 结果

3.1 酸枣仁汤对抑郁大鼠模型体质量的影响

结果见表1，第0天各组大鼠体质量无明显差异(P>0.05)，第21天后，与空白组相比 ，模型组体质量明显下降(P<0.01)；与模型组相比，酸枣仁汤低，中剂量组体质量明显增加(P<0.05)，酸枣仁汤高剂量组和氟西汀组体质量显著增加(P<0.01)。

组别n第0天第21天空白组8201.50±7.37245.38±7.4**模型组8198.00±4.89205.35±8.65ΔΔ氟西汀组8202.48±3.41241.28±5.42**酸枣仁汤低组8205.02±3.11230.30±4.29ΔΔ*酸枣仁汤中组8204.02±7.84234.05±9.52Δ*酸枣仁汤高组8204.63±3.12243.94±4.88Δ**

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01； 与空白组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

3.2 酸枣仁汤对抑郁大鼠模型糖水消耗的影响

结果见表2。第0天各组大鼠糖水消耗无明显差异(P>0.05)。第21天后，与空白组相比，模型组糖水消耗量显著减少(P<0.01)；与模型组相比，各给药组糖水消耗量均明显增加(P<0.05)。

组别n第0天第21天空白组885.53±7.52161.68±32.04**模型组883.55±8.6039.958±12.94ΔΔ氟西汀组880.28±8.55120.608±10.54*酸枣仁汤低组889.18±7.418102.73±38.38*酸枣仁汤中组888.828±7.358112.33±82.63*酸枣仁汤高组882.028±9.43108.13±23.62*

注：与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01； 与空白组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

3.3 酸枣仁汤对抑郁大鼠模型行为学的影响

结果见表3。第0天，各组大鼠行为学得分无明显差别(P>0.05)；第21天，与空白组相比，模型组行为学得分显著降低(P<0.01)，出现类似为抑郁症的症状，从行为学角度证明抑郁症模型造成功。与模型组相比，酸枣仁汤低，中剂量组行为学得分明显升高(P<0.05)，酸枣仁汤高剂量组和氟西汀组行为学得分显著升高(P<0.01)。

组别n第0天第21天空白组8102.73±12.8995.75±6.13**模型组8102.00±13.4424.51±6.02ΔΔ氟西汀组8110.24±12.3282.73±14.87**酸枣仁汤低组8104.25±7.6844.00±9.48ΔΔ*酸枣仁汤中组8111.52±11.8470.59±13.38Δ*酸枣仁汤高组8101.08±8.9898.25±14.41Δ**

注：与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01； 与空白组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

3.4 酸枣仁汤对抑郁大鼠模型海马β-catenin相对蛋白表达量的影响

结果见表4。与空白组相比，模型组大鼠海马β-catenin相对蛋白表达水平显著性降低(P<0.01)；与模型组相比，氟西汀组、酸枣仁汤高、中剂量组大鼠海马β-catenin相对蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。结果见表4。

组别n(β-catenin/β-actin)×100%空白组43.06±0.56**模型组40.75±0.22ΔΔ氟西汀组42.72±0.10**酸枣仁汤低组41.56±0.26ΔΔ*酸枣仁汤中组42.13±0.98**酸枣仁汤高组42.58±0.37**

注：与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01；与空白组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

3.5 酸枣仁汤对抑郁大鼠模型海马β-catenin的表达影响

结果见图1。与空白组相比，模型组大鼠海马β-catenin蛋白的表达条带明显变细，表明β-catenin蛋白表达减少；与模型组相比，各给药组的蛋白条带明显变粗，表明β-catenin蛋白表达增多，说明氟西汀组，酸枣仁汤各剂量组可改善β-catenin蛋白的表达。

图1 各组大鼠模型海马β-catenin与β-action的蛋白表达比较注：1.模型组；2.空白组；3.氟西汀药组；4.酸枣仁汤低组；5.酸枣仁汤中组；6.酸枣仁汤高组。

4 讨论

通过β-catenin的表达与抑郁症的关系研究发现，Wnt信号通路作为脑内调控神经元发育转导的重要信号通路，Wnt信号通路转导取决于细胞内β-catenin的水平，Wnt信号通路转导的关键是胞质中是否存在结构稳定的β-catenin[11]。在神经干细胞分化方面，通过研究发现转基因小鼠进行体内实验，其稳定活化的β-catenin基因能够促进神经髓干细胞分化成为感觉神经元。若β-catenin发生突变后，可导致感觉神经元大量流失，说明β-catenin在调控神经干细胞分化成感觉神经元方面起到重要作用。海马脑区β-catenin含量增加，能够快速产生抗抑郁效应[12]。

酸枣仁汤作为治疗虚烦虚眠虚寐的经典名方，具有有效的抗抑郁作用。本实验通过复制慢性轻度不可预见性应激抑郁大鼠模型，应用酸枣仁汤对抑郁模型大鼠海马β-catenin的表达做了相关研究。结果表明模型组大鼠体质量增长速度缓慢，糖水消耗较治疗组减少，行为学测试得分减少。模型组大鼠海马相对蛋白表达量显著性降低，其β-catenin的表达降低，而酸枣仁汤高剂量组可提高β-catenin的表达，优于酸枣仁汤低、中剂量组，起到良好的抗抑郁作用。因此可认为酸枣仁汤抗抑郁机制可能与促进神经元生存，抑制海马神经元细胞凋亡减少脑损伤密切相关。

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国家自然科学基金项目(No.81303044)

田旭升(1976-)，男，博士，副研究员，硕士研究生导师，主要研究方向：中医药干预精神疾病。

郭宏伟*(1966-),男，教授，硕士研究生导师，医学博士，主要研究方向：中国医学史，中国医学现代转型研究中精神疾病相关研究。

2016-08-30

R285.5

A

1002-2406(2017)01-0052-03

修回日期：2016-09-10