MicroRNAs在动脉易损斑块形成过程中的作用机制

郝玉蕾， 辛美萤， 朱 颖综述， 冯加纯， 马 迪审校

MicroRNAs在动脉易损斑块形成过程中的作用机制

郝玉蕾， 辛美萤， 朱 颖综述， 冯加纯， 马 迪审校

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是血管的慢性免疫炎症性疾病，其实质是血管壁、血流和血液有形成分三者中单发或多发性异常并相互作用所引起的复杂的病理生理过程，基本病理改变主要是动脉粥样硬化斑块形成。动脉粥样硬化斑块由最初的脂斑脂纹发展为复杂的易损斑块及破裂的过程中涉及多种病理改变。MicroRNAs是在进化上高度保守的单链非编码RNA序列，长度大约为22 bp，通过介导靶mRNAs的降解或者抑制其翻译在转录后水平发挥重要的基因表达调控作用，且彼此相互联系构成复杂而高度协调的调控网络，在机体的多种生物学过程中发挥重要作用。本文拟就microRNAs在易损斑块形成中的作用机制，探讨其作为易损斑块的新型血清学标志物的可行性，并为临床稳定斑块治疗寻找可能的作用靶点。

1 易损斑块概述

既往观点认为易损斑块具有如下特征：(1)薄纤维帽；(2)大脂质核心；(3)炎性细胞大量浸润；(4)内皮受损，血小板大量聚集等。新近发表的共识性文件提出易损斑块的如下诊断标准，主要标准：(1)活动性炎症，主要是斑块内单核细胞、巨噬细胞或淋巴细胞浸润；(2)大脂质核心，薄纤维帽；(3)血管内皮脱落，表面血小板大量聚集；(4)斑块裂隙；(5)血管狭窄程度≥90%；(6)新生血管形成。次要标准：(1)斑块表面钙化结节；(2)斑块呈亮黄色；(3)斑块内出血；(4)内皮功能异常；(5)血管正性重构；(6)炎性标志物表达水平上调。具有至少一条主要标准同时结合其他次要标准即可诊断易损斑块。由此可见，该诊断标准已不再局限于的传统病理学诊断指标，同时重视斑块内的代谢状况、组织成分等功能学指标。

2 MicroRNAs在易损斑块形成过程中的作用

易损斑块的形成与很多因素密切相关，包括血管平滑肌细胞(VSMCs)大量凋亡、胶原含量减少、炎症反应、新生血管化、钙化、脂质代谢异常、斑块所感受的血流机械应力、斑块的负荷形态等。

2.1 纤维帽变薄 纤维帽主要由胶原细胞和胶原基质组成。胶原基质包括胶原及弹性蛋白，胶原又分为Ⅰ和Ⅲ型胶原，主要由VSMCs合成和释放并受细胞因子的调控。纤维帽中胶原细胞和胶原基质的数量在斑块稳定性中具有重要意义。

易损斑块纤维帽中VSMCs大量死亡，胶原含量合成减少导致纤维帽变薄，易于破裂。Tang ST等研究结果表明[1]，利用miR-126处理小鼠动脉后，抑制了动脉内膜中VSMCs的凋亡，胶原含量升高，使斑块趋于稳定。研究证实[2]，血管内皮细胞(ECs)可以通过产生微囊泡(EMPs)将hsa-miR-148b释放至胞外并作用于VSMCs，通过靶向抑制HSP90的表达从而调控VSMCs的增殖和迁徙能力。AS患者斑块中hsa-miR-148b含量明显增多，使VSMCs内HSP90表达下调，导致VSMCs的凋亡。miR-21过表达可以抑制由ROS介导的VSMCs凋亡和坏死[3]。此外，VSMCs由收缩表型向合成表型的转化是易损斑块形成过程中的重要病理改变，合成型VSMCs表达更多的脂蛋白受体和清道夫受体，进而介导VSMCs病理性脂质摄取。VSMCs自身可以大量表达miR-143/-145，同时亦受来源于ECs微囊泡中miR-143/-145的调控。miR-143/-145作用于下游靶基因，例如KLF-4、KLF-5、血管紧张素转化酶，促使VSMCs向合成表型转化。然而，当血管内皮受损时，ECs释放大量EMPs，其内部的miR-143/-145的作用于VSMCs，抑制VSMCs的增殖和迁移，从而减少血管内膜新生，发挥抗AS的作用[4]。因此，miR-143/-145在易损斑块形成中的作用仍有争议。

纤维帽中胶原纤维合成受阻及分解增多，胶原基质含量降低使纤维帽变薄，斑块去稳定性。miR-145、miR-133a、miR-21及miR-29等参与调控VSMCs胶原合成和纤维化，对斑块的稳定性具有重要作用。ApoE-/- 小鼠VSMCs过表达miR-145可显著减小动脉粥样硬化斑块的体积，并使斑块内胶原含量增加、纤维帽覆盖面增大，从而使动脉粥样斑块趋向于静止，不易发生破裂[5]。此外，在VSMCs中INF-γ可抑制编码前胶原蛋白相关基因的表达，从而破坏纤维帽的完整性。miR-29可直接靶向作用于INF-γmRNA，抑制INF-γ的产生，维持斑块稳定性[6]。巨噬细胞源性的基质金属蛋白酶(MMPs)在纤维帽变薄和斑块去稳定性中发挥至关重要的作用。MMP-9是易损斑块中含量最多的MMPs，miR-133a可靶向作用于MMP-9调控其表达。此外，巨噬细胞中miR-21通过靶向抑制RECK(reversion-inducing cysteine-rich protein)从而间接调控MMP-9的表达[7]。miR-712可下调基质金属蛋白酶抑制剂TIMP-3，使蛋白聚糖裂解减少，活化整合素和MMPs[8]。最近研究表明[9]，miR-24表达下调可促进巨噬细胞凋亡并增强MMP-14的蛋白水解活性，从而加速动脉粥样斑块的进展并倾向于发展为易损斑块。

2.2 大脂质核心 脂质核心主要包括富含黏稠状粥样脂质物质的泡沫细胞、退化的血液成分、坏死组织碎片、胆固醇结晶等。其产生机制是由巨噬细胞吞噬大量脂质后，溶酶体破裂，使细胞自身溶解所致。在斑块进展期，大量激活的巨噬细胞通过胞葬作用清除凋亡细胞，使得凋亡细胞大量聚集，但另一方面又延迟炎症消散，并促使脂质核心进一步增大。研究表明当粥样物质在斑块中所占的比例大于40%时，斑块破裂的可能性明显增加。

内质网应激介导的相关通路，主要为未折叠蛋白反应，导致巨噬细胞的凋亡及进展期斑块的坏死破裂。在特定刺激的诱发下，miR-155可经内质网应激介导的相关通路介导巨噬细胞的凋亡。最近研究结果证实巨噬细胞miR-21上调可促进巨噬细胞的胞葬作用并抑制固有免疫反应[10]。此外，脂质核心中的胆固醇结晶除了对纤维帽具有直接破坏作用外，亦可通过活化NLRP3炎性复合体触发一系列炎症级联反应从而破坏斑块的稳定性。miR-223对NLRP3炎性复合体和IL-1β具有负性调节作用，可抑制相关的炎症反应，从而起到稳定斑块的作用[11]。

高同型半胱氨酸血症引起的动脉粥样硬化斑块中，miR-34a表达上调抑制组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)，对下游H3K9ac抑制作用降低从而促进总胆固醇(TC)、游离胆固醇和甘油三酯(TG)在泡沫细胞中的聚集。相反，抑制miR-34a的作用后，HDAC1表达增多抑制H3K9ac，减少泡沫细胞中胆固醇和甘油三酯的含量，发挥稳定斑块的作用[12]。

2.3 炎性细胞浸润 炎性细胞大量浸润是促使斑块破裂的重要诱发因素。病理学观察发现炎性细胞浸润多发生于斑块的“肩部”。浸润的炎性细胞以巨噬细胞为主，斑块的稳定性与斑块中巨噬细胞的数量密切相关。

少数研究表明microRNAs在巨噬细胞极化过程中发挥重要作用。miR-124通过靶向作用于CCAAT增强子结合蛋白-α(C/EBP-α)抑制巨噬细胞的活化，并抑制其由促炎表型M1向抑炎表型M2的转化，发挥稳定斑块的作用[13]。与此相似， miR-223通过靶向作用于PKNOX1抑制巨噬细胞向促炎活化表型转化，阻断miR-223的作用后，斑块内M1型巨噬细胞含量增多而M2型巨噬细胞含量减少，促使斑块趋于破裂[14]。Ye J等研究结果显示[15]，相对于健康对照，急性冠脉综合症患者CD14+单核细胞中miR-155水平明显升高。事实上，巨噬细胞中miR-155通过SOCS1-STAT3-PDCD4轴介导炎症介质的表达，在易损斑块的形成和破裂过程中发挥重要作用。过表达的miR-125b通过抑制INF调节因子-4可增强巨噬细胞对INF-γ的反应性，而miR-125a-5p 可作用于IL-4使M1型巨噬细胞减少并促进巨噬细胞向M2表型转化[16]。

2.4 内皮功能受损 ECs大量凋亡使ECs缺失、内皮完整性破坏，暴露出细胞外基质，继而引起血小板的黏附和聚集，刺激血栓形成。Li Y等实验结果证实[17]，miR-210直接结合于3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶K1(PDK1)mRNA 的3’-UTR，抑制PKD1的表达，进而激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，使ECs大量凋亡，内皮功能受损。有趣的是[18]，血小板可以释放含有miR-223的微囊泡，微囊泡被摄取后介导ECs产生晚期糖基化终末产物，诱导ECs凋亡。Welten SMJ等经实验证实[19]，miR-495在ECs增殖过程中发挥重要作用，抑制miR-495后动脉内膜新生明显减少，斑块稳定性增加，延缓斑块进展。 动脉易损斑块常形成于血流紊乱而机械应力明显增高的部位，当这些部位内皮受损时，miR-126-5p上调并作用于DLK1促进ECs增殖，血管发生再内皮化而有利于内皮功能恢复[20]。在机械应力和氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的双重打击下，AS易发部位 miR-92a 明显增高。动物实验研究表明，抑制 miR-92a 可减轻ECs炎症反应、斑块缩小，使斑块性质趋向于稳定[21]。

在血流机械应力、脂质代谢紊乱、炎性损伤等多种因素的刺激下，ECs损伤促使多种黏附分子表达上调，相关炎性细胞大量黏附聚集，是易损斑块形成的重要病理改变。ECs中NF-κB信号转导通路可调控许多与细胞黏附相关的促炎基因的表达，包括E-选择素(E-selctin)、P-选择素(P-selctin)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)以及多种细胞因子和趋化因子。作为ECs中大量表达的microRNAs之一，miR-126-3p可通过上述通路抑制VCAM-1的表达，从而干扰炎性细胞在内皮表面的黏附[20]。MiR-31和miR-17-3p亦可通过上述通路分别作用于E-selctin和ICAM-1，阻断肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导的ECs活化[22]。人体和动物实验表明[23]，miR-181b可靶向作用于核內输蛋白-α3(importin-α3)，影响NF-κB在胞核的定位，抑制其下游一系列细胞黏附分子的表达。MiR-1185通过VCAM-1和E-seletin干扰内皮正常功能，在AS的进展中发挥重要作用[24]。MicroRNA Let-7g (let-7g)通过抑制转化生长因子-β(TGF-β)及SIRT1可抑制ECs炎性激活，当let-7g受抑后，则ECs向促炎性活化表型转化[25]。

2.5 新生血管化 在进展期斑块内，ECs起源的新生血管形成最终导致新生血管侵及动脉内膜，动脉内膜遭到破坏，这一过程与斑块的进展、去稳定性和破裂紧密相关。研究证实microRNAs在血管重塑过程中具有重要的作用。在斑块内皮细胞miR-27b表达明显上调，通过作用于其下游靶基因Naa15促进血管新生，促进斑块去稳定性。通过下调ECs中miR-27b的表达，有望延缓斑块进展。Welten SMJ等研究结果表明[26]，Mef2a 可靶向作用于14q32 microRNAs包括 miR-329 和494，二者具有抗血管新生和抗血管动脉性功能的作用。当Mef2a表达受抑制后，增多的miR-329 和494可促进新生血管形成。VSMCs的增殖和迁移是内膜新生过程的重要环节。MiR-495靶向作用于多种下游基因，在血管新生、动脉形成、脂质代谢等方面发挥重要作用。利用基因沉默寡核苷酸(GSO)干扰miR-495后，VSMCs的增殖和迁移受到抑制，减少内膜新生，维持斑块的稳定性。此外，抑制miR-495后，血浆总胆固醇(TC)水平下降13%，极低密度脂蛋白(VLDL)水平亦有所下调[19]。

可以看出，microRNAs一方面可以发挥促新生血管形成的作用；另一方面又可以抑制新生血管形成。MicroRNAs作用的两面性提示我们microRNAs或许具有改变动脉粥样硬化斑块结局的潜在可能性。

2.6 血管钙化 动脉粥样硬化斑块的钙化是其发生破裂的又一重要危险因素。部分研究表明microRNAs可调控VSMCs的矿化作用，从而说明microRNAs在血管钙化中发挥重要作用。体外实验和体内实验中均证实miR-125b通过靶向作用于成骨细胞转录因子SP7介导血管钙化的发生[27]。临床研究结果表明，冠状动脉钙化患者与健康对照相比，其循环miR-134， miR-3135b和miR-2861表达上调，提示以上3种microRNAs可能与冠脉钙化相关[28]。

3 MicroRNAs作为动脉易损斑块的新型体液标志物的前景

鉴于动脉粥样硬化斑块破裂的严重后果，亟需可以作为斑块进展和破裂的可靠的新型生物学标志物。近来，随着对microRNAs在斑块发生发展及破裂中的重要调控作用的认识不断加深，microRNAs作为新型体液标志物或许将成为可能。microRNAs可作为新型体液标志物主要与其以下特性有关：(1)microRNAs来源广泛，主要通过微囊泡或细胞死亡释放到外周循环；(2)性质稳定；(3)便于获取，microRNAs广泛存在于血液、尿液等便于获取的细胞外液中；(4)利用特定的microarray或实时定量反转录PCR技术可灵敏检测到其量的改变；(5)microRNAs通常具有组织或疾病特异性，这是其作为体液标志物的重要特性。

冠脉疾病患者血浆内皮细胞表达的miR-17、miR-92a、miR-126、miR-181b水平下调，血管平滑肌细胞表达的miR-145下调，单核巨噬细胞或活化的T淋巴细胞表达的miR-155上调。通过对急性冠脉综合症患者血浆异常表达microRNAs情况的研究，有望得出提示易损斑块破裂的microRNAs异常表达谱。相对于单一microRNAs作为标志物，异常表达谱的确立，将大大提高预测斑块破裂的可行性。此外，将miR-212与血红蛋白A1c、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、脂蛋白a协同用于斑块损伤的预测，提示患者血浆特异性microRNAs水平联合心血管疾病高危因素用于斑块损伤评估将大大提高斑块损伤预测的可靠性[29]。

随着研究不断深入，越来越多的易损斑块相关的microRNAs及其相关的靶基因被揭示出来。值得注意的是，其他的非编码RNA，例如lncRNAs，在动脉易损斑块形成和破裂中的作用及其与microRNAs的相互作用引起了人们的重视。虽然仍存在诸多问题，但细胞培养和动物模型研究的深入将为我们展现microRNAs在动脉易损斑块形成和破裂中的作用，甚至可能实现动脉易损斑块的靶向治疗。

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(吉林大学白求恩第一医院神经内科和神经科学中心，吉林 长春 130021)

冯加纯，E-mail:fengjcfrank@yahoo.com.cn；马 迪，madi16@126.com.cn

1003-2754(2017)08-0759-03

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