甜叶菊物理诱变育种的发展

张正鹏

（甘肃省武威市凉州区农业技术推广中心，武威733000）

甜叶菊物理诱变育种的发展

张正鹏

（甘肃省武威市凉州区农业技术推广中心，武威733000）

介绍了诱变育种的原理、优点、诱变剂及其技术，综述了甜叶菊物理诱变育种（γ照射、重辐射、离子束、紫外线）研究的发展。为快速培养高品质甜叶菊新种质提供参考。

甜叶菊；物理诱变育种；γ照射；诱变剂；甜菊糖；甜菊糖苷；莱鲍迪苷

全世界己有几十个国家利用诱变技术诱变植物，成功选育了几千个品种。据联合国粮农组织和国际原子能机构（FAO/IAEA），在突变品种数据库（MVD）至少收集3233个突变品种。约77%的突变作物品种是由种子繁殖，以种子繁殖而不是其他营养繁殖可很好提供突变诱导原始原料[1]。60%的作物突变品种是在亚洲生产的，而中国人贡献超过25%。在MVD，谷物在所有突变的作物品种中几乎占一半（48%），其次是花类（20%）、豆类（14%）、蔬菜、饲料、食用油植物和树木和其他（3%）。这些品种，创造了巨大的经济和社会效益。甜叶菊作为一种天然的非热量的、安全的高甜度甜味剂，其发展显示出巨大的潜力，甜菊糖特别是莱鲍迪苷A（Reb A）口感好没有任何副作用。甜菊糖还具有抗微生物、抗真菌、防病毒、抗炎、抗高血压、抗高血糖、抗肿瘤、抗腹泻、利尿和调节免疫功能等治疗和保健功能[2]，应用和需求广泛，而且在不断增长和发展。因此需要采用多种方法和途径创造、培育产质量高的、多样性的甜叶菊品种满足生产与商业发展需要。如果群体出现较少的变异性状，有些性状只能通过突变育种而改善。与传统的育种程序相比，诱变育种是在短时间扩大变异性、分离可取的经济性状的潜在的方法，对改良甜菊糖产量与质量有很大价值与可用性[3]。国内外研究人员使用各种诱变方法与技术进行了甜叶菊新种质的培养与甜菊糖的改良[2-3]。为此将该方面的研究予以综述，总结经验，为将来更快速创新更优良的甜叶菊新品种进而满足人们日益增长的需求做贡献。

1 诱变育种的原理、技术及物理诱变特点

1.1 诱变育种的原理

诱变或突变是指个体在环境条件下发生遗传变异的过程。自然界中发现的变异是植物进化过程中发生的自然突变的积累，除了自然突变，通过物理和化学诱变剂诱变创造突变体已广泛应用不同作物的科学领域中。它是进化中的主要因素，因为不同世代间发生的变化可发展成新的个体、种和属[4-5]。突变可以发生在两个方面：基因碱基和/或染色体的数量或结构的变化。突变体被定义为具有永久性遗传变异的活生物，可用分子方法或通过表型工具区分[2]。总的来说，诱变剂处理损害细胞核DNA，随机诱变的新突变在DNA修复机制的过程可遗传[1]。这些改变也在细胞质发生，导致染色体或基因组突变使植物育种者挑选有利的突变体[5]。然而，诱变育种主要用物理和化学方法产生诱变，而其他突变的类型通常在功能基因组学研究中发现[6]。

1.2 诱变育种的优点及成效

由于自然突变率较低，植物育种家寻求新的育种技术，诱发突变的目的是增加突变频率以便选择合适的变异[2，5]。因此，突变育种是在进化过程中为获得所需的性状或特征提供一种替代的方式。诱变育种较传统育种方法和转基因（GMO）更有优势[5]。诱导突变的主要优点是：可形成多性状突变体，不同于转基因的方式只一个单独性状；突变诱导可以帮助建立突变系的范围，确定特定性状的基因，为分子功能基因组学研究建立分子基因数据库支撑，对于未来植物品种的发展增加生物信息学[2]。

1.3 物理诱变技术的特点

用诱变技术有助于创造选定的理想性状的突变体。诱变剂分为可分为物理和化学诱变剂[1]。为了扩大遗传多样性，通过植物种子，营养体如茎段、嫩枝芽和块茎经诱变剂处理诱导突变提高作物种子和无性繁殖的生产力[5-6]。据报道，突变诱导对无性繁殖作物更有效[2]。物理诱变剂是用来直接开发突变品种最常见的诱发突变技术，用于诱导突变的辐射类型分为紫外线（UV）辐射和电离辐射[1]。波长250～290nm的紫外线只限于处理无细胞的外来组织（即发育中的花粉粒和花粉管的生殖细胞），因为它们有适度的渗透能力和轻度的生理损伤而无大妨碍。电离辐射（X射线、γ射线、快中子和热中子，α和β粒子、重辐射、离子束等）对植物组织有更好的穿透能力，可诱导更多的化学变化；电离辐射各有自己的特性和变化[1，5]。物理诱变剂影响植物诱变率的两个关键因素是能量和穿透力。但其他参数，如，源的可用性和可访问性，诱变剂的适宜性，处理和后处理的安全管理，和处理费用，都可影响一个特定诱变剂的性能[7]。γ照射由于其广泛的可用性和多功能性其使用设施是优选的。在植物诱变，利用外部的放射性同位素钴-60（60Co）、铯-137（137Cs）和小范围的钚-239（239Pu）的蜕变发射γ射线。一般来说，所有的γ辐照器是被隔离防护，只有训练有素、认证的人员可以管理辐照源，有特别的预防措施以避免意外发生[1]。γ细胞辐照器，在γ射线源有一种放射性同位素，通常用于急性照射（即在短时间内高剂量照射植物）；与此相反，慢性照射（即长时间低剂量照射植物）可在γ辐照室、γ温室或γ场进行[7]。γ射线是短波长电离辐射但穿透力高，使原子或分子相互作用产生自由基，这些自由基能破坏或改变植物的细胞成分[8-9]。电离过程分为三大机制：光电效应、康普顿散射和γ射线穿过植物组织产生电子偶[7]。根据照射水平，它们影响植物的种子萌发、形态、解剖、生化和生理，γ射线引起组织水平的形态学显著变化和细胞水平的生化反应[1]。

2 物理诱变技术在甜叶菊育种中的应用

2.1 γ射线在甜叶菊中的应用

所有物理诱变剂中，最常用的是γ射线和X射线[1]。据FAO/IAEA报告，在过去的40年中，应用γ射线诱导突变已经广泛化，而X射线的使用却显著下降；γ射线是最有能量的电磁辐射，从10 keV至几百keV都很有能量[8]。通过γ射线照射植物开发大量有用的突变体成为可能，并在无性繁殖植物表现出越来越大的潜力，特别是甜叶菊[2]。已进行了γ辐照处理甜叶菊植物诱变育种的研究。

S Pande等研究了γ射线对S.rebaudiana体外培养的影响。所使用的剂量分别为5、10、15、20、25和30 kR。将种子用γ射线辐照进行愈伤组织诱导，愈伤组织增殖和体细胞胚胎发生在MS+2.5 mg/L 2,4-D培养基中。高剂量γ射线照射的外植体坏死，体细胞胚胎发生率随γ辐射剂量的增加而降低，其发生显著受高剂量的γ射线影响。植株产生的种子经γ射线5～10 kR（可能为Gy）剂量照射影响愈伤组织诱导生长；经γ射线高剂量如25 kR和30 kR（可能为Gy）照射的种子延迟愈伤组织诱导生长。表明低剂量的γ射线辐射甜叶菊生产变异性是有效的[10]。γ辐射有助于开发甜叶菊糖含量高的新品种。Shahid等对不同的繁殖技术（体外和体内）和γ辐射对甜菊糖苷（STV）和Reb A含量的影响进行了研究，种子和愈伤组织经不同剂量的γ射线照射，其致死剂量（LD50）为8.75 Gy和生长指数GR50为13.33 Gy。2.5 Gy剂量的γ照射处理种子的发芽率（20%）最高（对照为23.31%）。种子和愈伤组织培养获得小苗。甜菊种子辐射后体外芽培养获得的STV含量较高（2.808±0.070mg/g DW），比其他体内和γ照射的组织高[11]。

确定诱变剂的有效使用剂量能够以最小的副作用诱导理想的突变体，是确保突变诱导成功的关键[2]。高剂量不可避免地增加死亡率和不育性，而较低的剂量可使植物在处理后恢复。因此，为了获得诱变剂有效的剂量，在进行材料大量照射前确定致死剂量LD50是至关重要的[12]。LD50是指发生突变频率最高，幸存的一半死亡、另一半存活的剂量。LD50的值根据不同的植物属、种而不同[2]。例如，甜叶菊的急性照射LD50是29 Gy，慢性照射LD50是45 Gy[10]，木薯（Manihot esculenta L.）的LD50是27.5 Gy，麻疯树（Jatropha curcas L.）为600 Gy，豌豆（Pisum sativum L.）为200 Gy[2]。Norazlina等成功地进行了γ射线处理甜叶菊繁殖和离体诱变研究。结果，茎尖在添加1 mg/L KTMS培养基培养3周后显示最高的丛生芽诱导和增殖（5.50±1.95a）。敏感性试验鉴定甜叶菊芽LD50和选择体外诱变的有效剂量。在0、10、20、30、40、60和80 Gy剂量进行急性和慢性γ射线照射。甜叶菊的急性照射LD50是29 Gy，慢性照射LD50是45 Gy。筛选的有效剂量为10、20、30和40 Gy。低剂量和高剂量γ射线照射的芽存活率差异显著。所有非辐照芽和在10 Gy剂量照射的芽均达到100%的存活率，且形成的新芽数量最高，分别为5.00±1.98和5.06±1.98。随着辐射剂量的增加，茎尖存活率下降。60和80 Gy剂量，芽尖0%存活，全部死亡。随着γ剂量的增加，甜菊幼苗成活率显著下降。急性照射的有效剂量为10、20和30 Gy，这3个选定的剂量被用于甜菊芽的体外诱变[13]。

γ辐照对甜叶菊愈伤发生和活性物质生产有影响，γ辐照显著改变愈伤组织颜色和形态，STV和生物量生产不同剂量显示没有大的变化；愈伤组织培养物15 Gy剂量略有提高酚醛树脂和类黄酮含量的生产，20 Gy剂量增强DPPH为基础的抗氧化活性[14]。处理叶子突变育种在改善甜叶菊性状上起到很重要的作用。叶片愈伤组织接种于MS+BA 1 mg/L+NAA+IBA+GA3 0.3 mg/L培养基。30d后，生长旺盛的愈伤组织转移到新鲜培养基，并经γ辐照（5、10、15和20 Gy）处理。结果，观察到γ射线剂量越大越抑制愈伤组织的增殖，增殖率88.61%～79.16%（对照为95.83%）。同样，10、15和20 Gy剂量诱导的愈伤组织呈易碎、颗粒和松软状，对照则紧凑。此外，5、10和20 Gy剂量显著降低愈伤组织鲜生物量（FCB），而15 Gy剂量FCB（1660mg）比对照（1520mg）增加。色谱数据显示15 Gy剂量STV含量（0.251mg/g DCB）比对照组（0.232 mg/g DW）略有提高，而其他的剂量STV含量下降。在20 Gy的愈伤组织培养物中观察到较高的抗氧化活性（88.73%）。在15 Gy处理愈伤组织培养观察到较高的总酚含量（TPC；43.90 mg/g DCB）和总黄酮浓度（TFC；6.87 mg/g DCB）。结论：S.rebaudiana经γ射线辐照并未出现愈伤组织培养的生物量和生物活性化合物生产的主要变化[14]。Awad也报道了甜叶菊在γ辐射剂量20 Gy和30 Gy总碳水化合物增加，剂量10 Gy和20 Gy总蛋白含量增加，核酸RNA增加而总DNA下降[15]。杜尚广等采用5、15、30、60、90、120和150 Gy剂量的60Co-γ射线对甜叶菊茎段进行处理，得出60Co-γ射线诱变的LD50为24 Gy，处理后的甜叶菊形态差异显著，随着辐射剂量的增强，甜叶菊死亡率在增加，5～30Gy剂量死亡率为1.7%～20.5%，60～150 Gy剂量死亡率为92.7%～100%；5～30 Gy辐射剂量，可溶性多糖含量比对照高15.29%～76.77%[16]。

体细胞无性系变异被认为是重要的变异来源，已证明在番茄、马铃薯、小麦、水稻、高粱、玉米、大蒜等作物上是可行的。Ali等将微繁殖6周龄的甜叶菊组培苗茎尖和节段分别以0、750、1500和2250 R剂量的γ射线辐射处理，获得适宜外植体后，在愈伤组织诱导培养基上培养，愈伤组织转移到再生培养基中添加0、0.2%、0.4%和0.6%的NaCl。结果，茎尖外植体愈伤组织诱导率（82.5%）高于节段外植体（75.6%）；茎尖外植体获得的再生根（75.0%）也高于节段外植体（62.5%）。有些植株相对耐盐胁迫。随着γ射线剂量的增加，愈伤组织诱导和根形成逐渐减少。γ射线0 R剂量（对照组）生根数最高，所有盐度浓度平均值为4.7。随着盐度浓度的增加，生根数减少。关于γ射线和盐度共同作用的影响，比盐度或γ射线的单独作用，对生根数量影响更大。γ射线剂量为0、750、1500和2250 R（0、7.5、15和22.5 Gy）外植体愈伤平均数分别为7.9、2.8、2.5和2.25。0.6%盐度最低数量γ射线剂量15和22.5 Gy时生根数为0.5[17]。

2.2 重辐射、离子束和紫外线的应用

以甜叶菊鲜叶片为实验材料，利用近红外光谱仪，进行甜叶菊重离子辐照的诱变效应研究，结果表明，重离子辐射可提高甜叶菊种子发芽率，但对细胞具有严重损伤作用[18]。

为发掘创建甜叶菊抗、耐寒性突变种质，以重离子辐照剂量60、80 Gy处理甜叶菊品种守田2号干种子，结果两种处理甜叶菊种子成活率分别为42%和33%，获得的两株甜叶菊抗寒品系，其含糖量较高，STV含量与Reb A含量比对照品种分别高30%和22%，新品系2007-800-5平均干叶产量为222kg/667m2，比对照守田2号增产13%。总苷（STV+Reb A）含量13.3%，RA占总苷的75.5%，比对照高8.6个百分点，属于高糖苷、特极品，已审定命名为安甜菊四号[19]。

离子注入诱变技术是通过加速气体离子轰击生物材料，使生物大分子及细胞发生损伤，这种损伤不易修复，突变体能较快稳定，且在存活率较高的情况下可得到较高的突变率；用于辐照的离子参数多样，能拓宽突变谱[19]。闵笛等用不同剂量低能N+离子注入甜叶菊种子，结果，经辐照后植株高度、叶片、叶面积和糖苷含量都得到提高；低剂量的N+离子束能促进甜叶菊发芽率，高剂量则抑制其发芽率；随着辐照剂量的增高，植株的株高和甜菊糖含量等呈先下降后升高的趋势[20]。苏婷婷研究了4个不同剂量的N+离子束辐照甜叶菊种子，结果，随着剂量增加发芽率增加，超过600×2.5×103N+/cm2剂量，发芽率下降，（200～600）×2.5×103N+/cm2三个剂量10d的发芽率为57.33%～68.33%（对照56.33%），其中400×2.5×103N+/cm2剂量对发芽势和发芽率改善最显著。经N+离子束辐照后，M1代植株中筛选出高糖苷突变体9株[21]。

杨敬敏等评论了60Co-γ辐射和离子束注入对甜叶菊5个杂交组合后代突变的影响，结果，两种处理对甜叶菊后代植株有明显的诱变效应，经60Co-γ和离子束注入的甜叶菊杂交后代种子发芽率均显著低于对照，经60Co-γ注入的杂交后代幼苗成活率显著高于对照，但经离子束注入的幼苗成活率显著低于对照；除叶宽外，经离子束注入的杂交后代植株的其他7个生长指标均显著高于60Co-γ注入的植株。它们表现出较低的高度，一致的叶形状，较少的分支，节间长度短，抗倒伏、耐寒[22]。为改善甜菊糖品质，以藤仓赤霉Gibberella fujikuroi为出发菌株，采用紫外（UV）和5-溴尿嘧啶（5-BU）及EMS复合诱变的方法，确定UV诱变的最佳剂量为12W、25cm，辐照120s，EMS化学诱变的最佳剂量为0.10mol/L、处理时间8min。筛选得到26株初选菌株，其中MS05和MS17菌株发酵效果最好且可稳定遗传，发酵后Reb A含量比对照分别显著增加22.98%和18.55%。两菌株发酵甜叶菊叶片提取液的Reb A含量比发酵前分别提高48.25%和39.69%[23-24]。

3 展望

尽管上述物理诱变技术在甜叶菊上进行了一定的应用研究，但甜叶菊的研究范围仍然有限，所获得的结果还远不能满足生产和商业的需求，仍需要进一步开发甜菊糖产质量更高的甜叶菊新品种（系）。通过对甜菊的研究，总结并探索γ射线与其它物理或化学等方法创新整合技术，培养优良的理想性状的甜叶菊新种质是可能的，将为甜叶菊和甜菊糖生产第一大生产国的中国的发展注入新的力量。

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Development of Physical Mutation Breeding of Stevia

ZHANG Zheng-peng
(Agricultural Technology Service Center of Liangzhou District,Wuwei 733000,Gansu)

The principle,advantages,mutagen and mutagenesis technology were introduced.The development of physical mutagen(gamma irradiation,physical mutagenesis of heavy ion beam radiation,ultraviolet)breeding research in Stevia was summarized to provide references for the rapid creation of high quality Stevia germplasms.

Stevia;physical mutation breeding;gamma irradiation;mutagen;steviol glycoside;stevioside; rebaudioside A

S566.9

B

1007－2624（2017）05－0061－04

10.13570/j.cnki.scc.2017.05.019

2017-04-04

张正鹏（1984-），甘肃武威人，硕士研究生，农艺师，主要从事农业技术服务与推广工作。