免疫避孕疫苗的研究进展

樊姝彤 尤新国 满 怡 综述 潘智芳 冯卫国 审校

潍坊医学院细胞生物学教研室（山东潍坊 261053）

免疫避孕疫苗的研究进展

樊姝彤 尤新国 满 怡 综述 潘智芳 冯卫国 审校

潍坊医学院细胞生物学教研室（山东潍坊 261053）

世界人口的高增长率和非意愿妊娠的高发生率一直影响着社会经济发展和人类身体健康。传统的避孕方法（输精管结扎、激素类避孕药以及避孕套等）都存在一定的局限性[1]。有研究发现，输精管结扎术后中远期会出现附睾淤积增厚的超声表现[2]。因此，寻找一种安全、方便、有效、可逆的避孕措施对控制人口增长和避免非意愿性妊娠具有十分重要的意义。免疫性避孕的基本原理是选择与生殖过程相关的关键抗原，删除其抑制性表位、自身抗原交叉反应表位等一些非优势抗原表位，添加促使机体发生免疫应答的T细胞表位，再与相应的载体相偶联，最终制成避孕疫苗，诱导机体产生相应的体液免疫或细胞免疫应答，从而达到阻止受孕的目的[3]。本文对抗精子疫苗、抗卵透明带疫苗和抗生殖激素疫苗作一综述。

一、抗精子抗原避孕疫苗

现已证明，精子膜表面携带大量的自身和同族抗原，为了避免与其他组织发生交叉反应，抗精子疫苗的研究重点不仅是要寻找精子膜表面的特异性表达蛋白，而且还要避免交叉反应产生的自身免疫病。目前已经鉴定了几种抗原，并且已经克隆并测序了编码这些抗原的互补DNA（c DNA）。其中值得注意的有：受精抗原FA-1（fertilization antigen-1），一种精子特异性糖蛋白,与男性和女性的免疫性不孕均相关；PH-20（yaluronidase），一种透明质酸酶诱导信号转导的受体和识别透明带的受体[4]；PH-30（fertilin），普遍认为PH-30和顶体反应过程中卵子卵透明带密切相关以及精子蛋白（SP-10），SP-17（sperm protein 17），睾丸特异性抗原-1，蛋白A激酶锚定蛋白（AKAP）和乳酸脱氢酶C4同工酶LDH-C4（LDH-C4）等。其中LDH-C 4是第1个被推荐进行Ⅰ期临床试验的精子抗原。有研究发现，雌性动物与其中一些抗原（FA-1，PH-20和SP-17）的主动免疫已显示降低体内生育力。最近，在一项研究中，用附睾蛋白（Eppin）免疫雄性猴，78%的猴子对Eppin产生高抗体滴度，导致不育，随着抗体滴度的降低，其中有71%的雄性猴在免疫后恢复生育力[5]。基于以上实验的研究基础，有学者推测，即使筛选出最佳精子抗原，是否一定可以被自然产生的精子凝集抗体所识别，目前还难以做出结论。

二、抗卵透明带（ZP）疫苗

卵透明带（zona pellucida，ZP）是围绕哺乳动物卵母细胞及着床前受精卵外的一层半透明的酸性糖蛋白膜，具有一种特异的精子受体，其作用为调节特异的精卵结合、诱导获能精子发生顶体反应并阻止多精受精。人类的ZP含有4种主要糖蛋白：ZP1、ZP2、ZP3和ZP4[6]，其中ZP3是精子的第一级受体，有精子受体活性, 起始精卵结合和顶体反应，在免疫研究中较重要[7]。ZP疫苗的作用机制是抑制受精过程，以ZP为抗原免疫多种实验动物都可以达到免疫避孕的效果[8]。实验表明[9]，抗ZP3抗体与ZP3结合后，一方面，抗体占据了ZP3上的精子结合位点，使精子不能与ZP3结合而发生顶体反应,从而导致受精失败。另一方面，抗原（ZP3）-抗体复合物还阻断了卵母细胞与其周围颗粒细胞之间的信号联系,导致初级卵泡的闭锁、退化。当用同源或异源ZP3蛋白免疫动物后，可以激起被免疫动物高滴度的抗体反应，产生的血清抗体IgG可以与自身ZP3结合。当抗ZP3抗体水平增多时，动物不孕；若抗体水平下降到正常水平，动物的生育力得到恢复。抗ZP疫苗可分为以下几类：

（一）天然来源的ZP3免疫不孕疫苗

早期ZP3免疫避孕的研究中，人们用天然ZP蛋白直接免疫动物。由于天然来源的猪 ZP糖蛋白3（pZP3）很容易得到，且与多种物种的 ZP 糖蛋白具有交叉免疫反应，故将pZP3作为首选的天然 ZP 糖蛋白，直接免疫动物观察其避孕效果。用pZP3主动免疫猴，其体内产生了高滴度的抗体反应，产生的抗pZP抗体与猴自身ZP结合，被免疫猴在一段时间内可以保持不孕。在用天然ZP蛋白直接免疫达到避孕目的的同时，被免疫动物出现了较为严重的卵巢炎，表现为卵巢功能紊乱，原始卵泡衰竭，排卵周期、激素水平和卵泡发育均发生了短暂的变化。产生这种副作用的机制尚不明确，推测的可能原因是当用同源性较大的ZP3免疫时，在免疫原上存在着一些表位，被抗原提呈细胞提呈后，引起的 T细胞免疫从而发生自身免疫反应造成卵巢炎[10]。鉴于pZP有50%～70% 的避孕效果，迄今为止，pZP已成功抑制了80种野生哺乳动物的生育力[11]。由于pZP会诱发严重的卵巢炎，因此其并不适用于人类临床实际。

（二） 重组ZP蛋白免疫不孕疫苗

ZP在免疫中存在的问题是：ZP疫苗在避孕的同时往往会引起卵巢自体免疫性损伤。进一步研究发现细胞毒性T细胞引起卵巢炎和卵巢功能障碍[12]，是由于完整ZP抗原既有T细胞抗原决定簇，又有B细胞抗原决定簇。为避免这种损伤，免疫原应仅具有选择性B细胞抗原决定簇而缺乏T细胞抗原决定簇。但是，为了激起抗体反应，T细胞表位又是必需的。通过基因工程获取重组ZP蛋白成为时下必然的发展趋势，研究者们将筛选出来的含有B细胞表位的ZP3多肽与其他亲缘关系较远的含T细胞表位的蛋白相连，构建成嵌合多肽用于免疫动物，达到了降低生育力和减少副作用的目的。应用能与B细胞抗原决定簇发生特异反应的单克隆抗体（单抗）来选择ZP蛋白的合成肽片段。Lou[13]将ZP3中第336位密码子TTC（苯丙氨酸）替换为GCT（丙氨酸），可使B6AF1小鼠不再发生自身免疫卵巢炎。陈享等[14]用此ZP3作为抗原，与外源辅助性T细胞表位牛核糖核酸酶T细胞抗原（BRNT94-104）相偶联，诱导了B细胞免疫应答，避孕率达到了60% 。以中国仓鼠卵巢（CHO：Chinese Hamster Ovarian）细胞中表达的重组人ZP1、ZP2 和 ZP3 蛋白免疫猕猴和狒狒，均达到了很好的免疫不育效果且不引起卵巢病变[15]。近年，有研究发现[16]，用大肠杆菌表达的无标记重组融合蛋白（TT-KK-ZP3）， 在近交系FVB/J雌性小鼠中产生高抗体滴度，与空白对照组相比，免疫的小鼠显示出显著的低生育力。以上都说明重组的 ZP 糖蛋白具有很好的免疫原性，但同种ZP抗原免疫，有可能导致严重的卵巢炎。目前虽然重组ZP疫苗已有大量的动物实验研究, 但尚无人体实验的报道。

（三） ZP合成肽免疫不孕疫苗

研究证明存在于zona蛋白质中的“致卵成分”的T细胞表位可能是ZP抗原免疫后观察到的卵巢功能障碍的原因[17]。近年来，为了避免ZP3蛋白作为免疫原时引起自身免疫疾病，研究者们推测，通过寻找和保留免疫原（ZP3）上的B细胞表位，除去引起不良反应的T细胞表位，就可以避免副作用的发生。但是，为了激起抗体反应，T细胞表位又是必需的。因此，人们将“混杂”T细胞表位组成的嵌合肽免疫的牛RNase与小鼠ZP3（335-342aa；被Ala取代的Phe 336）的最小B细胞表位共线性合成，从而导致生殖力的削减而没有卵巢功能障碍[18]。用白尾鹿ZP1肽（79-130aa）[19]和野生小鼠ZP3肽（328-342aa）[20]免疫也导致生育力的显著降低。有研究发现以ZP3（334 -343aa）和ZP4（251-273aa） 单独的合成肽或两者融和的合成肽分别免疫小鼠，诱导产生的抗体可识别天然 ZP，免疫血清可明显抑制荧光标记的 ZP3与获能精子的结合[21]。这些研究证实, 基于 ZP的合成肽疫苗能激发具有生物活性的抗体。然而，能用于人群切实可行的避孕疫苗还需要进一步研究。

（四）病毒载体ZP蛋白

近年来，有研究者用含T细胞表位的外源病毒载体来免疫动物，以产生抗卵ZP的免疫反应。Choudhury等[22]以单独表达 ZP3 和精子特异性抗原 YLP12 的，或表达两者融合蛋白的花叶病毒（mosaicvirus）来免疫雌鼠，均诱导小鼠产生特异性抗体，并导致其生育率下降。体外实验发现[23]，mstZP3[301～320aa]与破伤风毒素蛋白嵌合多肽可以抑制人类精卵结合，抑制率可达60%，卵巢功能未见异常。Smith等[24]将含鼠 ZP3 的鼠源巨细胞重组病毒（MCMV-m ZP3）接种兔子，诱导产生了高滴度的mZP3 特异性抗体，但该特异性抗体与兔 ZP3 无交叉免疫反应。以上均说明用病毒载体制备免疫避孕疫苗有着广阔的应用前景。

如上所述，抗卵透明带疫苗的共同问题是卵透明带抗原免疫引起的卵巢功能紊乱。有研究者普遍认为黏膜免疫是克服卵透明带抗原免疫引起卵巢功能紊乱的一种有效方法。董志炜等[25]成功制备pVAX1-pZP3α壳聚糖纳米微粒，小鼠口服此类疫苗能诱发生殖道黏膜免疫,产生抗生育效应,对卵巢组织结构没有影响。有研究组[26]发现人B细胞表位的最小模体可以避免 ZP3 特异的卵巢源性 T 细胞抗原表位。因此，设计抗 ZP 疫苗的靶抗原时，将ZP上T细胞和 B细胞的抗原表位分开, 用含B细胞抗原表位为免疫原,可以有效提高疫苗的安全性, 避免引发卵巢炎。

三、抗生殖激素疫苗

避孕疫苗的生殖激素抗原主要有：GnRH、LH及hCG 等，以此为靶抗原研制成的疫苗显示了不同程度的避孕效果。

（一）抗LHRH /GnRH疫苗

十肽黄体生成素释放激素（LHRH）具有一些独特的特征，它存在于男性以及女性中，因此针对LHRH的疫苗可用于两性。雄性动物中，LH结合LHR作用于睾丸的间质细胞,促进其分泌雄性激素[27]，对睾酮的分泌和精子的形成具有重要的调控作用。Dunshea等[28]发现，青春期和青春期后期的公羊和公猪在其脂肪组织中积累雄激素、雄激素衍生物和代谢废物，这给肉类带来不愉快的气味。用抗LHRH疫苗进行免疫可以减少睾丸激素，消除污点，从而提高肉质。而被免疫的动物也比对照组生长得更快[29]。Suresh等[30]用羊LH疫苗免疫冠毛猕猴，发现所产生的抗体能有效结合LH，睾酮浓度降低，精子细胞的生成受抑制，细胞数减少，最终导致无精子症的结果，提示LH疫苗也有一定的精子抑制作用。而近期有研究者发现LH免疫后与其他垂体激素发生交叉反应，产生了抗体滴度低、生殖器官萎缩和性功能下降或丧失等副作用，所以没有再进一步研究[31]。

GnRH是一种由下丘脑合成及分泌的10肽，刺激垂体分泌促卵泡激素（FSH）和黄体生成素（LH），起着调节促性腺激素释放的功能。普遍认为，GnRH疫苗具有相对更广泛的抗生育能力。目前GnRH疫苗主要应用于动物模型，而人类GnRH疫苗则主要应用于性激素依赖性疾病[32]，例如在前列腺癌的治疗中。研究发现，用GnRH疫苗免疫成年雌、雄性白尾鹿均能产生长期（2年）的避孕效果，雄鹿丧失性欲，雌鹿的妊娠率降低了88%[33]。虽然抗GnRH 疫苗的避孕效果可靠，但其靶器官较多，如卵巢、睾丸、胎盘、前列腺等其作用复杂，最终可能导致不育[34]。但是由于抗体中和GnRH而导致其生物活性无法表达，性激素水平降低，导致性无能和生殖器官功能受到伤害等，使GnRH疫苗无法适应于人类。

（二）人绒毛膜促性腺激素（hCG）疫苗

hCG疫苗是第一个也是唯一一个成功通过Ⅱ期临床试验的避孕疫苗，已证明可以保护性活跃妇女不会怀孕[35]。这种疫苗的独特之处在于它是针对hCG制成的分子，只有在健康女性怀孕期间才能发挥作用。目前h CG主要以全β亚基和以羧基末端肽（hCGβ-CTP）为免疫原来研制避孕疫苗。

1. 以β-hCG亚单位为抗原的避孕疫苗：Charrel-Dennis等[36]使用完整的 β-hCG为抗原肽研制出基因水平表达的 hCG 突变型 GA68 疫苗（即谷氨酸替换第68位的精氨酸），避免了与hLH的交叉。为了增强β-h CG的免疫原性，研究者们将其与破伤风类毒素（TT）相偶联，对以β-hCG-TT为免疫原的避孕疫苗进行了研究，肯定了此类疫苗的抗生育能力且无明显的毒副作用。最新成果是构建了β-hCG-LTB重组融合蛋白, 该蛋白有效地提高了各种属鼠的抗体滴度, 克服了抗体应答的个体差异[37]。

2. 以β-hCG羧基端37肽为抗原的避孕疫苗：β-hCG-CTP 疫苗去除了 hCG 分子中与 TSH 、FSH及LH有高度同源性的 α 亚单位，在 hCG 的 β 亚单位上去除了与 LH 的 β 亚单位相似的结构部分，成为 hCG 所独有的特异抗原肽。有研究者采用β-hCGCTP作为hCG的特异性抗原，选择白喉类毒素（DT）作载体，MDP-1作佐剂，制成hCGβ-CTP-DT避孕疫苗进行临床Ⅰ期试验，能产生很高的抗体滴度，但是没能表明此疫苗具有避孕效果。在世界卫生组织人类生殖研究发展和培训规划署利用β-h CG-CTP为免疫原的实验中[38]，因在受试者身体出现极强的组织反应而宣告终止。

3. β-hCG的异种二聚体（HSD）避孕疫苗：prhCGβ-TT和hCGβ-CTP-DT疫苗免疫原性比较弱，体内产生的抗体滴度低，持续时间较短，个体间免疫效果差异大，少数妇女出现卵巢功能损伤等现象[39]。Talwar实验室为了改进hCG疫苗，将hCGβ与羊LH的α亚单位（α-o LH）结合形成异种二聚体制成HSDTT/DT疫苗，其免疫原性强于pr-hCGβ-TT和hCG β-CTP-DT/TT[40]。在完成Ⅰ期临床试验后，Talwar在1994年进行了Ⅱ期临床试验，结果显示，抗hCG抗体滴度大于50 ng/m L时则避孕，小于35 ng/mL时则受孕，但这种避孕疫苗需连续接种3次才能达到预期半年的避孕效果[41]。

（三） FSH和FSH受体（FSHR）疫苗

卵泡刺激素（FSH）是垂体前叶嗜碱性细胞分泌的分子量约为33000kD的一种糖蛋白激素。在男性FSH与FSH受体（FSHR）结合后与雄激素的共同作用，促使睾丸支持细胞合成和分泌雄激素结合蛋白等物质，促进精子形成[42]。抗FSH特异性抗体是通过消除内源性FSH的生物学活性而影响精子发生，不影响LH的合成与分泌，因此睾酮合成不受影响。FSH与促甲状腺激素（TSH）和黄体生成素（LH）具有相同的α亚基，仅β亚基表现出各自的特异性。向延芳等[27]应用部分重叠PCR技术将FSH-β和Occludin相偶联，通过特异性靶向干扰睾丸内Sertoli细胞间紧密连接（TJs）蛋白的生物活性,特异性抑制或干扰精子发生和射精，达到可逆性避孕目的。然而有研究发现，在雄性动物实验中，用FSH或FSHR疫苗免疫非人灵长类动物，仅仅能导致精子减少，不能完全阻断精子产生[43]。

四 、展望

理想的避孕疫苗具有强免疫原性，可以不使用任何有潜在毒性的佐剂（如弗氏佐剂）就可以产生高抗体滴度，而且单次免疫就可以达到较好的避孕效果，维持时间长，具有可逆性。目前仍然没有一种适应于人类的免疫避孕疫苗。随着免疫学和DNA重组技术的快速发展，以及生物信息学技术的发展和基因敲除技术的普及，免疫避孕疫苗的研究难点必将会被逐一解决，为避孕疫苗带来更广阔的发展空间。

致谢：本课题受山东省科技发展计划（2015GSF 118178）；山东省卫计委科技项目（201411）资助

疫苗, 避孕 ; 生殖系统

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（2016-12-28收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.03.016

R 169.41