沙眼衣原体感染不育男性的精液质量与IL-6、IL-8水平的相关性分析

张玉勤

顺德区妇幼保健院（广东佛山 528300）

沙眼衣原体感染不育男性的精液质量与IL-6、IL-8水平的相关性分析

张玉勤

顺德区妇幼保健院（广东佛山 528300）

目的探讨沙眼衣原体感染不育男性的精液质量与IL-6、IL-8水平的关系。方法选择2015年2月至2016年6月我院收治的不育男性250例，收集患者的血液、首段尿（FVU）和精液标本，分别检测血清特异性IgA、IgM、IgG抗体、 FVU和精液沙眼衣原体DNA、精液IL-6、IL-8浓度，并进行精液常规分析。分析沙眼衣原体感染患者的IL-6、IL-8水平变化，及与精液常规参数等指标的相关性。结果（1）尿液、血清衣原体阳性患者IL-6和IL-8水平与正常生育男性比较均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）IL-6和IL-8水平与白细胞浓度均具有相关性，且IL-8水平与精液体积和患者年龄相关。结论FVU沙眼衣原体阳性的男性精液体积明显低于阴性者，IL-6和IL-8水平与白细胞浓度呈正相关。IL-8水平与精液体积呈负相关而与男性年龄呈正相关。

衣原体, 沙眼; 不育, 男性; 精液; 白细胞介素6; 白细胞介素8

沙眼衣原体感染是常见的男性生殖道感染疾病，主要通过性生活传播，且对男性的生殖功能影响较大[1]。沙眼衣原体感染是发生梗阻性无精子症的危险因素，主要通过影响精子发生或损伤成熟精子来降低男性生育力[2]。沙眼衣原体感染会引起慢性炎症反应，其抗原刺激诱导巨噬细胞应答并产生炎症因子，这些炎性因子可能通过独立的机制影响男性生育力。研究发现，慢性沙眼衣原体感染男性IL-6和IL-8水平升高，且这些细胞因子在炎症反应的免疫应答中发挥重要作用[3]。然而，沙眼衣原体感染男性的IL-6和IL-8等炎症因子是否与精液质量存在相关性，目前报道存在分歧。Kokab等[4]研究发现沙眼衣原体感染男性精液中IL-8水平显著高于非感染患者，但IL-6与沙眼衣原体感染之间无相关性；IL-8水平升高与精液量增多有关，而与其他的精液质量参数无关，但这项研究通过检测精液和尿液沙眼衣原体进行诊断，而不考虑血清学情况，难以解释精液炎症因子水平是否与近期或过往沙眼衣原体感染有关。因此，本研究通过精液、首段尿沙眼衣原体抗原和血液特异性IgA、IgM、IgG抗体综合诊断衣原体感染，并探讨其与精液IL-6、IL-8水平及精液质量的关系。

资料与方法

一、一般资料

2015年2月至2016年6月我院男科共收治男性不育患者324例，选择其中250例入组。入选患者年龄21～52岁，婚后正常性生活2年以上不育，无外伤及遗传性疾病家族史，无性功能障碍，同时患有沙眼衣原体感染。排除染色体核型异常、放化疗史、输精管切除史、少精液症（＜1mL）、逆行射精、低促性腺素性功能减退的患者；研究内容及过程均通过医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书，并采集精液、2mL血液及20～40mL尿液样本，进行前瞻性研究。

二、方法

（一）精液处理及分析

患者禁欲2～7d后手淫法采集精液，参照2010年WHO五版《人类精液分析与检验实验室手册》[5]进行精液分析。精液置于37℃培养箱孵育至完全液化，观察并测量精液外观、黏稠度、pH值及体积，精液体积采用称量法测量；精液稀释适当倍数并充池Goldcyto精子计数板，采用西班牙CASA系统分析精子的浓度、活力。精子活力分为前向运动（PR）、非前向运动（NP）和不动（IM）三级。精液白细胞检测采用过氧化物酶染色法，染色呈棕色且圆形的细胞即为白细胞。制备精子涂片，采用改良巴氏法染色，封片，1000×油镜观察，精子形态分类参照WHO第五版手册。

（二）尿液、精液DNA提取及巢式PCR

所有尿液和精液标本中DNA均采用QIAamp DNA Mini Kit （Qiagen）试剂盒提取，参照试剂盒说明进行操作。提取的DNA均储存于-20℃冰箱内。巢式质粒PCR参照Claas等[6]报道的方法，两对引物用于检测沙眼衣原体。一对引物源于沙眼衣原体共同的内源性质粒，可生成所有血清型沙眼衣原体特异的517bp产物。第二对引物为第一对引物内部序列，可扩增320bp产物。PCR程序为25个循环，包括变性94℃ 30s，退火42℃ 30s，延伸72℃ 30s。延伸时间增加到9min。参照Saiki等[7]的方法，精液DNA首先检测β-globin，以确定待检样品中是否存在PCR酶抑制剂。当β-globin阳性时，针对隐蔽性质粒进行巢式PCR，产物均使用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。每次PCR以血清型E、LGV作为阳性对照。

（三）血清学检测

血清中沙眼衣原体特异性IgA、IgM、IgG抗体检测采用免疫荧光试剂盒（Focus），纯化抗体固定于玻片上，血清样本解冻并稀释，根据试剂盒建议，IgG血清抗体稀释64倍，IgA稀释32倍，IgM稀释20倍。稀释的患者血清与抗原37°孵育30min，洗涤去除未结合的血清。添加抗人IgG，IgA，IgM荧光标记抗体并37℃孵育30min，洗涤去除未结合成分，自然干燥并封片，采用leica荧光显微镜DMIRB进行观察，400倍先扫描典型荧光，再在1 000×油镜确定存在荧光或无EB样的非典型荧光。阳性反应表现为明亮的苹果绿色荧光，背景为黑色，试剂盒自带阴性对照和阳性对照。

（四）精液IL-6和IL-8浓度测定

精浆解冻后采用PBS稀释，IL-6和IL-8样品分别稀释2倍、4倍。取100mL稀释样本，采用ELISA法检测。试剂盒为（R&D Systems），参照试剂盒说明书操作。每一个测试孔均在30min内测定OD值，波长为450nm。

三、统计学分析

采用SPSS18.0统计分析数据。符合正态分布的数据采用描述统计学和独立样本 t 检验分析。非参数数据采用曼-惠特尼秩和检验。IL-6、IL-8水平与精液参数的相关性采用Spearman相关性分析。均以P＜0.05表示有统计学差异。

结 果

一、沙眼衣原体感染情况分析

11例患者尿液衣原体DNA为阳性，占4.4%。血清学结果显示，IgM+3例，占1.2%；IgG+45例，占18.0%；IgA+0例。精液标本中均未检测到衣原体DNA。IL-8水平分析

二、衣原体感染阳性及阴性患者精液IL-6和

表1显示尿液、血清学检测衣原体感染阳性及阴性患者精液中IL-6和IL-8浓度的平均值，中位数，第25百分位数，第75百分位数及范围。结果显示，尿检衣原体阳性患者精液IL-6和IL-8水平比正常生育男性显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；IL-6和IL-8阴性组与正常生育男性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。血清衣原体阳性患者IL-6和IL-8水平与正常生育男性比较均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；IL-6和IL-8阴性组与正常生育男性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

三、精液IL-6、IL-8水平与精液参数等指标的相关性分析

表2显示精液中IL-6、IL-8浓度与男性年龄、不孕年限和精子参数的相关性分析。采用Spearman相关性分析，结果显示，IL-6和IL-8浓度均与精液白细胞浓度显著相关（P=0.027，P=0.011）。与其他参数的相关性分析，仅IL-8水平与精液体积呈负相关（P=0.004），而与男性年龄呈正相关（P=0.013），见表2，图1-4。

表1 精液IL-6、IL-8水平与尿液衣原体DNA、血清特异性IgG 检出情况的关系（pg/mL）

表2 精液IL-6、IL-8水平与年龄、不育年限及精液参数的相关性分析

四、衣原体感染情况与精液参数的相关性分析

表3比较了尿液、血清学检测衣原体阳性与阴性患者的精液参数，结果显示尿液衣原体DNA阳性患者的精液体积显著低于未感染者（P＜0.05）。IgG阳性组患者精液pH值高于阴性者，但两组比较差异无统计学意义（P＞0.05），且不动精子百分比显著低于IgG阴性组（P＜0.05）。尿检衣原体抗原阳性患者精液白细胞数量升高，但无统计学差异（P＞0.05）。

讨 论

图1 IL-6 与白细胞浓度相关性分析

图2 IL-8与白细胞浓度相关性分析

图3 IL-8与男性年龄相关性分析

图4 IL-8与精液体积相关性分析

表3 尿液衣原体DNA、血清特异性IgG阳性患者年龄、不孕年限及精液参数与阴性患者比较（x ±s）

本研究结果显示FVU衣原体抗原阳性患者精液质量与阴性者比较，仅精液体积显著降低；其作用机制可能与衣原体感染引起的慢性炎症反应导致生殖系统管道堵塞有关，与Wolf等[8]报道结果类似。而Hosseinzadeh[9]、AL-Mously[10]及Kokab[4]等研究认为，衣原体感染可能引起生殖附属腺体及生殖上皮细胞分泌活动增强；王中兴等[11]研究又显示合并沙眼衣原体、解脲支原体及细菌感染的男性不育症患者精液体积、精子浓度与正常生育男性精液比较无明显差异，与本研究结果有差异。本研究结果又显示，血清学特异性IgG+抗体阳性患者精液IL-6浓度及pH值均升高，与Marconi[12]和Kokab[4]等报道结果类似。衣原体感染阳性患者精液IL-8浓度升高与精液体积下降具有相关性，与Hosseinzadeh[9]、AL-Mously[10]及Kokab[4]等报道的精液体积增加相反。目前还未明确造成结果差异的原因，但预测可能与本研究中精液DNA未受影响、部分男性仅有尿道炎病史及患者的禁欲时间差异等因素有关。精液IL-8浓度也与男性年龄直接相关，可能是生殖附属腺感染或良性前列腺增生（BPH）的标志[10]。多篇研究报道了精液IL-8在BPH触发、发展、转归及男性年龄增长中的重要作用[13-15]。近期研究未发现年龄和精液体积间的相关性，而IL-8和精液体积明显相关，且由附属腺体炎症反应、衣原体感染、其他病原体感染和附睾管阻塞引起[12]。然而，精液中其他的微生物也能诱导炎性反应及细胞因子水平的变化[16]，可能是本研究结果的干扰因素。

衣原体感染阳性患者IL-6、IL-8均显著高于正常生育男性患者，这结果支持AL-Mously[10]等关于精浆中IL-6、IL-8水平可能是上生殖道感染（例如前列腺炎）标志的观点。AL-Mously[10]、曹志彬[17]等研究显示IL-6、IL-8水平均为前列腺炎症的标志，且IL-8也与尿道感染相关，IL-8水平与男性年龄具有正相关性，提示高水平IL-8患者可能患有前列腺炎。精液中IL-6、IL-8水平均与高浓度白细胞有关，提示存在炎症反应或感染，与Eggert[18]、Kokab[4]等研究结果类似。因此，沙眼衣原体感染导致的精浆白细胞介素水平升高、尤其IL-6水平显著升高时提示前列腺感染。尿道衣原体检测阳性预示近期感染，且精液量减少与IL-8浓度升高和前列腺炎症反应有关。沙眼衣原体感染和慢性前列腺炎预示发生前列腺癌的危险[19]，但该观点并无可接受的病因学联系，且存在争议性，需通过更多的研究证实。

许多研究认为，慢性前列腺炎患者精液质量下降及免疫反应导致的IL-8水平升高与沙眼衣原体的感染具有相关性。然而，所有研究均基于沙眼衣原体感染阳性或者有前列腺炎药物史的基础上进行。本研究中男性均无症状，且入组并完成所有的诊断后才获取血清学结果；招募患者时未知诊断结果及不育因素，保证了研究结果的真实性。

1 La Vignera S, Condorelli RA, Vicari E, et al. Microbiological investigation in male infertility: a practical overview. J Med Microbiol 2014; 63(1): 1-14

2 Sobinoff AP, Dando SJ, Redgrove KA, et al. Chlamydia muridarum infection-induced destruction of male germ cells and Sertoli cells is partially prevented by Chlamydia major outer membrane protein-specific immune CD4 cells. Biol Reprod 2015; 92(1): 27

3 刘燕婕, 周慧. 衣原体属与支原体属感染及细胞因子水平和男性不育的相关性研究. 中华医院感染学杂志2013; 23(16): 3828-3829, 3882

4 Kokab A, Akhondi MM, Sadeghi MR, et al. Raised inflammatory markers in semen from men with asymptomatic chlamydial infection. J Androl 2010; 31(2): 114-120

5 Sánchez-Álvarez J, Cano-Corres R, Fuentes-Arderiu X. A Complement for the WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. EJIFCC 2012; 23(3): 103-106

6 Claas HC, Melchers WJ, De Bruijn IH, et al. Detection of Chlamydia trachomatis in clinical specimens by the polymerase chain reaction. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1990; 9(12): 864-868

7 Saiki RK, Scharf S, Faloona F, et al. Enzymatic amplification of b-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985; 230(4732): 1350-1354

8 Wolff H, Neubert U, Zebhauser M, et al. Chlamydia trachomatis induces an infammatory response in the male genital tract and is associated with altered semen quality. Fertil Steril 1991; 55(5): 1017-1019

9 Hosseinzadeh S, Eley A, Pacey AA. Semen quality of men with asymptomatic chlamydial infection. J Androl 2004; 25(1): 104-109

10 Al-Mously N, Eley A. Interaction of Chlamydia trachomatis serovar E with male genital tract epithelium results in secretion of proinfammatory cytokines.J Med Microbiol 2007; 56(Pt 8): 1025-1032

11 王中兴, 刘浩, 吴丽娟, 等. 男性不育症患者中常见病原体感染对精液参数的影响. 生殖医学杂志 2016; 25(4): 364-367

12 Marconi M, Pilatz A, Wagenlehner F, et al. Impact of infection on the secretory capacity of the male accessory glands. Int Braz J Urol 2009; 35(3): 299-308

13 叶海云, 侯树坤, 白文俊, 等. 慢性前列腺炎患者前列腺液 IL-6 和 IL-8 表达变化及意义. 中华泌尿外科杂志2003; 24(4): 279-281

14 Penna G, Fibbi B, Amuchastegui S, et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol 2009; 182(7): 4056-4064

15 柳良仁, 刘振华, 杨璐, 等. 前列腺液中白细胞介素8水平与良性前列腺增生患者组织炎症及下尿路症状关系的研究. 中华泌尿外科杂志 2014; 35(12): 953-954

16 Cai T, Wagenlehner FM , Mondaini N, et al. Effect of human papillomavirus and Chlamydia trachomatis coinfection on sperm quality in young heterosexual men with chronic prostatitis-related symptoms. BJU Int 2014; 113(2): 281-287

17 曹志彬, 王元天, 薛蔚, 等. 慢性前列腺炎患者前列腺液中 IL-17 的表达及与 TNF-α, IL-8, IL-6, IL-10 相关性分析. 中国男科学杂志 2014; 28(2): 51-54

18 Eggert-Kruse W, Rohr G, Kunt B, et al. Prevalence of Chlamydia trachomatis in subfertile couples. Fertil Steril 2003; 80(3): 660-663

19 Stasiewicz D, Starosławska E, Brzozowska A, et al. Epidemiology and risk factors of the pr ostate cancer.Pol Merkur Lekarski 2012; 33(195): 163-167

（2017-03-06收稿）

Correlation analysis between semen quality and the levels of seminal IL-6 and IL-8 in Chlamydia trachomatis infection-caused male infertility

Zhang Yuqin
Shunde District Maternal and Child Health Hospital, Foshan 528300, Guangdong, China

ObjectiveTo study the relationship between semen quality and the level of seminal IL-6 and IL-8 in C. trachomatis infection-caused male infertility.MethodsTotal of 250 infertile men were recruited in the study, and their blood, frst void urine (FVU ) and semen samples were collected. Analysis for specifc IgA, IgM and IgG antibodies to C. trachomatis in serum, the presence of C. trachomatis in FVU and semen sample and semen analysis were carried out. IL-6, IL-8 levels and semen parameters were comparatively analyzed in C. trachomatis infection-caused infertile male.Results(1) Chlamydia trachomatis positive male seminal plasma IL-6 and IL-8 levels increased, but no signifcant difference, and with the diagnosis method. (2) IL-6 and IL-8 levels were associated with leukocyte concentrations, and IL-8 levels were associated with semen volume and patient age.ConclusionThis study showed that semen volume of C. trachomatis infection- positive infertile male was lower than that of the men without infection. Relationship among IL-6, IL-8 level, and leukocyte were observed, and IL-8 level was negatively correlated with semen volume, while positively correlated with age.

Chlamydia trachomatis; infertility, male; semen; Interleukin-6; Interleukin -8

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.03.010

R 698.2