芪蓝胶囊对前列腺癌血管生成拟态形成的影响研究*

俞旭君尤耀东李俊君常德贵阳 方董 良吴天浪**

1. 成都中医药大学（四川成都 610075）；2. 成都中医药大学附属医院

芪蓝胶囊对前列腺癌血管生成拟态形成的影响研究*

俞旭君1尤耀东2李俊君1常德贵1阳 方1董 良1吴天浪2**

1. 成都中医药大学（四川成都 610075）；2. 成都中医药大学附属医院

目的观察芪蓝胶囊对前列腺癌血管生成拟态（Vasculogenic mimicry，VM）形成的影响，探讨芪蓝胶囊干预VM形成的作用规律及“量-效”关系。方法采用细胞的3D培养技术建立前列腺癌细胞（PC-3）体外培养体系，将3D培养的细胞随机分为：空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组4组。采用不同剂量的芪蓝胶囊含药血清分别干预上述组别，48h后在电镜下进行观察。结果空白组中可见VM形成的各类表现，管状形态良好。芪蓝胶囊低剂量组的VM数量较空白组略少，管腔通道形成尚可。中、高剂量组别仅见极少量直行通道形成。结论芪蓝胶囊能够有效控制前列腺癌VM的形成，并且随着剂量的增加，VM被抑制得更加明显。

芪蓝胶囊; 前列腺肿瘤; 血管生成拟态; 剂量效应关系, 药物

血管生成拟态（Vasculogenic mimicry, VM）是前列腺癌血管生成的重要环节，是肿瘤组织维持持续性血液供应的一种新型血供模式[1]。芪蓝胶囊是成都中医药大学男科团队经过8年多的临床总结和筛选，由黄芪、绞股蓝、蜣螂、土茯苓和葫芦巴5味药物组成。前期研究表明能够改善前列腺癌患者排尿症状和提高生活质量。本研究主要观察不同剂量芪蓝胶囊含药血清对体外3D培养的前列腺癌细胞VM生成情况的作用，以揭示其作用机制。

材料与方法

一、材料

（一）细胞

人前列腺癌PC3细胞（中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库）

（二）动物

SPF级SD雄性大鼠20只，320～350g，成都达硕生物科技有限公司，SCXK（川）2013-24。动物接收后进行适应性观察3～7d，合格后开始试验，用于含药血清制备。

（三）主要试剂和设备

BeaverNanoTM3D细胞培养水凝胶（苏州，海狸）；DMEM/F-12培养基（美国，Corning）； 12孔培养板（美国，Corning）；一次性微孔滤器（美国，Merck Millipore）。

低温冷冻离心机（德国，Heraeus）；相差倒置显微镜（日本，OLYMPUS）；微量加样枪及Tip头（德国，Eppendorf）；超净工作台（江苏苏净）。

二、方法

（一）芪蓝胶囊药液制备

1. 芪蓝胶囊组成：黄芪20g，绞股蓝20g，葫芦巴15g，蜣螂5g，土茯苓10g。

2. 制备方法与质量控制：制备方法：芪蓝胶囊以汤剂（合剂）形式在临床上应用，对水提取工艺确定了最佳工艺条件为：将黄芪、绞股蓝、葫芦巴、蜣螂、土茯苓置煎器内，加水1000mL，煎30min，滤取药液。药渣加水600mL，再煎20min，滤取药液。将两次煎出液合并，即得。为给药方便将药液浓缩为100mL，即生药量0.7g /mL。

质量控制：参照2010年版《中国药典》对各药材的相关规定进行质量检查，出具质量检查报告书。

（二）芪蓝胶囊含药血清制备[2]

20只SD大鼠随机分为2组：空白对照组、实验组，每组10只。芪蓝胶囊按临床等效剂量的10倍灌胃给药，空白对照组给予生理盐水，按10ml/kg体质量灌胃。每天上午、下午各1次，连续3d，末次给药1h后，腹主动脉取血，离心分离血清，56℃水浴30min灭活，分装，-80℃冻存备用。制备含药血清后，采用串联质谱检测含药血清中主要指标成分，包括黄芪甲甙、胡芦巴碱等。

（三）实验用细胞准备及操作方法

1. 细胞复苏：液氮罐中拿出PC-3细胞冻存管，迅速放入37℃水浴，连续摇晃使之在2min内融化后，将细胞转移至离心管，加入DMEM/F-12 2mL，吹打混匀。离心5min后，吹打使混匀成单细胞悬液。将制备的悬液移至容量25mL的培养瓶中，加入DMEM/ F-12（含10%FBS）5mL。

2. 细胞传代培养：细胞株置于37℃、5% CO2培养箱进行培养。常规添加双抗，每3天进行换液。当瓶底细胞分布达80%时进行传代。加入1mL浓度为0.25%的胰酶，37℃恒温箱内3～6min进行消化，倒置显微镜观察，出现贴壁细胞胞质回缩，细胞形态从原来的梭形成为椭圆形，并有少量细胞出现脱落。终止消化：加入5mL原培养液以中和胰酶，用2mL吸管轻轻多次吹打，至细胞完全脱落，形成细胞悬液。将悬液移至离心管中，离心5min。弃去上清液，加入1mL DMEM/F-12使细胞再次悬浮，然后装入3个新的培养瓶。每个培养瓶加含10%FBS的DMEM/F-12培养基5mL，置于37℃、5% CO2恒温培养箱中继续培养，直至获得足够数量的细胞用于实验。

3. 细胞计数：清洗计数板及盖玻片，吹干备用。吸管轻轻吹打使细胞混匀，马上吸取数滴悬液，移至1.5mL EP管。盖上玻片，再次吹打、混匀悬液，随即用移液枪吸取10μL，轻轻加入到计数板边缘，使之刚好充满计数板和玻片间空隙。计算细胞数，压方格线时只计左、上线，右、下线不计在内。如密度过高，可先稀释再计算。计算公式：（方格细胞数/4）×104×稀释倍数。共计数3次，取平均值。

4. 三维细胞培养（BeaverNano™ 3D细胞培养方法）：使用涡旋震荡仪将水溶胶室温下处理30min，降低黏度，同时避免产生气泡。然后将水凝胶原溶液、无菌蔗糖原溶液和去离子水按比例配制成2×水凝胶工作液。离心收集经胰蛋白酶消化过的细胞，将细胞悬浮在5mL无菌蔗糖工作液中，重复一次，配制成2×细胞工作液。然后将等体积（2×）细胞工作液加到（2×）水凝胶工作液中，然后轻轻将两者混合均匀制成水凝胶-细胞混合液。将水凝胶-细胞混合液加入到细胞培养板孔中，将细胞培养液沿着细胞培养板孔边缘轻轻注入到水凝胶-细胞混合液上部。最后，将载有3D细胞培养皿的细胞培养板置于二氧化碳培养箱中进行培养，过程中更换二次培养液，经过12h的3D培养后，更换一次新鲜细胞培养液，同时加入含药血清。

（四）分组与结果判定

1. 分组：将3D培养的细胞随机分为4组，即空白对照组、芪蓝胶囊低、中、高剂量组，每组设3个复孔。

2. 含药血清剂量：芪蓝胶囊含药血清按10%，5%，2.5%（培养体系体积比）设置高、中、低剂量组给药，不足10%的组别用胎牛血清补足；空白组采用10%大鼠空白血清给药，作用时间48h。

3. 形态学监测及VM判定：采用显微镜对培养孔中的细胞进行观察。良好的VM镜下表现形式可以为直的、平行排列的、十字交叉的、彩虹样的（没有完全封闭）、有分支的彩虹样的、封闭的环状和网络状的通道。结构越呈现出立体的管状或分支状态，说明VM的形态越好。

结 果

一、模型的建立

所有组别均成功建立前列腺癌PC-3细胞3D培养模型。

二、空白组VM形成的表现

空白组中可见VM形成的各类表现，如直的、平行排列的、十字交叉的、彩虹样的（没有完全封闭）、有分支的彩虹样的、封闭的环状和网络状的通道（图1）。

三、芪蓝胶囊低剂量组VM形成的表现

芪蓝胶囊低剂量组可见直的、平行排列的、十字交叉的、彩虹样的(没有完全封闭)、有分支的彩虹样的通道，但数量较空白组少（图2）。

四、芪蓝胶囊中、高剂量组VM形成的表现

芪蓝胶囊中、高剂量组仅见极少量直行通道形成，没有明显的立体管状结构（图3）。

图1 空白组VM形成的表现

图2 芪蓝胶囊低剂量组VM形成的表现

图3 芪蓝胶囊中、高剂量组VM的表现

讨 论

VM作为一种肿瘤生长和进展的血液供应模式之一[3]，早在1999年由Maniotis等[4]报道，随着研究的深入认为VM是肿瘤特别是早期肿瘤血液供应的主要途径。它是一种无内皮衬覆的血液通道，是早期肿瘤的功能性微循环。随着肿瘤的进展，VM逐渐演变成肿瘤细胞内的马赛克血管形式，最后随着内皮细胞的长入，形成了内皮依赖性血管[5]。这种新的血供模式是肿瘤在自身高速发展的需要下，肿瘤细胞自身为获取更多的血供而发生的变形，出现了管道样的供血管道[6]。

目前3D培养技术已经广泛运用于肿瘤研究的实验中，便于多方位观察肿瘤细胞的组合形态，以及在肿瘤发生发展中的生长方式。本实验采用BeaverNano™ 3D细胞培养技术，以水凝胶作为PC-3细胞3D培养的支架，成功培养出一个从立体层面展现前列腺癌细胞VM生成状态的实验模型。

芪蓝胶囊是成都中医药大学男科团队经过8年多的临床总结和筛选，前期多项实验研究和临床观察结果提示能够有效改善前列腺癌患者下尿路症状、最大尿流率及提高患者生存质量[7]，并于2015年成功获得国家发明专利（发明专利号：ZL201310492315.8）。芪蓝胶囊由黄芪、绞股蓝、蜣螂、土茯苓、葫芦巴5味药物组成。组方紧扣气血、寒温共调之法，是其临床疗效的基本保障。方中重用黄芪为君，合绞股蓝以补中焦之气，调和气血；土茯苓合葫芦巴，寒温并用，温化水湿而不燥，清湿热而不伤正；蜣螂善行易走，能入三焦，引药入经，直达病所。五药合用，使整方具有能温能补，不燥不滞，寒热气血兼顾的特点。现代药理学研究表明：黄芪具有增强人体免疫、抑制肿瘤血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡、增强其他抗肿瘤药物疗效以及促雌激素样等作用[8,9]，黄芪能诱导肿瘤细胞凋亡，通过调控癌基因和抑癌基因，来影响蛋白的表达[10]。绞股蓝能阻断肿瘤细胞有丝分裂、干扰肿瘤细胞 DNA合成、提高抗基因突变的能力，其主要成分有皂苷、黄酮类、多糖等，对许多肿瘤细胞具有较为显著的细胞毒样作用[11,12]，其黄酮类化合物槲皮素对多种肿瘤具有抑制作用，有对抗自由基的作用，逆转肿瘤细胞的多药耐药性，调控抑癌基因和原癌基因，增强抗癌药物的敏感性等[13]。土茯苓的现代药理学发现其内含有糖类、皂苷、黄酮苷、有机酸等物质，对荷瘤小鼠S180的实体瘤具有抑制作用[14]，能明显增加大白鼠的排尿总量，从而具有利尿作用[15]，还具有抗血栓、细胞免疫抑制样作用、抗菌、阵痛等作用[16]，故土茯苓对于PCa患者的排尿症状具有一定的改善作用。葫芦巴的种子提取物可使雄性大鼠的精液质量下降，呈现抗雄激素样作用[17]，还具有抗炎、抗氧化、抗溃疡等作用[18]，故其抗前列腺肿瘤的机制一方面是其抗雄激素样作用，另一方面是其本身的提取物对肿瘤细胞具有干预作用。蜣螂提取物可以通过抑制睾酮向双氢睾酮转化，从而阻断其作为雄激素刺激前列腺增生的作用，同时对大鼠血清雌激素含量和雌/雄激素比例具有调节作用，明显抑制前列腺的增生[19,20]。综合组方药物的现代药理学科学地阐释了芪蓝胶囊治疗前列腺癌的作用机制。

本实验通过芪蓝胶囊含药血清的干预，结果证实了该药能明显抑制体外3D培养模型中前列腺癌细胞组织VM的形成，这种效果在中剂量、高剂量组体现的更为明显。因而我们可以推测芪蓝胶囊通过对前列腺癌组织中血管生成过程的抑制，延缓了肿瘤组织的发展，从而改善患者的临床症状。由于缺乏一个长期的临床观察随访，因此这种对肿瘤组织发展的延缓作用是否能延迟肿瘤的转变抑或延长患者的生存期，还需进一步的临床探索。

1 Su F, Li B, Wang J, et al. Molecular regulation of vasculogenic mimicry in human uveal melanoma cells: role of helix-loop-he-lix Id2 (inhibitor of DNA binding 2). Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 2009; 247(3): 411-419

2 王洪武, 倪青, 林兰. 中药含药血清的研究进展及其在中医学中的应用. 北京中医药 2008; 27(9): 698-701

3 Maniotis AJ, Folberg R, Hess A, et al. Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro:vasculogenic mimicry. Am J Pathol 1999; 155(3): 739 -752

4 Maniotis AJ, Folberg R, Hess A, et al. Vascular channel formation by hunman melanoma cells in vivo and in vitro: Vasculogenic mimicry. Am Pathol 1999; 155(3): 739-752

5 Zhang S, Guo H, zhang D, et al. Microcirculation patterns in different stages of malanoma growt. Oncol Rep 2006; 15(1): 15-20

6 刘见荣, 侯风刚. 肿瘤血管生成拟态研究新进展. 现代肿瘤医学 2013; 21(4): 898-902

7 陈承. 芪蓝胶囊对去势后前列腺癌（气虚血瘀型）患者多中心、大样本的临床增效作用研究. 成都: 成都中医药大学, 2015

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12 Chen JC, Lu KW, Tsai ML, et al. Gypenosides induced G0/G1 arrest via CHK2 and apoptosis through endoplasmic reticulum stress and mitochondria-dependent pathways in human tongue cancer SCC-4 cells. OralOncol 2009; 45(3): 273-283

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18 兰卫, 高晓黎, 毛新民. 葫芦巴药理作用的研究进展. 西北药学杂志 2008; 23(5): 335-336, 封3

19 蒋巧梅. 蜣螂抗前列腺增生症药效物质基础研究. 成都中医药大学, 2009年硕士论文

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（2017-03-08收稿）

Effects of Qi-lan Capsule on vasculogenic mimicry in prostate cancer＊

Yu Xujun1, You Yaodong2, Li Junjun1, Chang Degui1, Yang Fang1, Dong Liang1, Wu Tianlang2**
1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075 Sichuan, China;
2. The 1st Teaching Hospital, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Corresponding author: Wu Tianlang, E-mail: wusu5356@163.com

ObjectionTo observe the effects of Qi-lan capsule on the formation of Vasculogenic mimicry in prostate cancer, and investigate its intervention effect on VM formation and the dose-effect relationship.MethodsProstate cancer cells (PC-3) were cultured using 3D cell culture method. The 3D PC-3 cells were randomly divided into four groups: blank control group, low dose group, medium dose group and high dose group. The cells in these groups were treated with pharmaceutic serum with different doses of Qi-lan capsule, and the treated cells were observed under electron microscope after 48 hours.ResultsThe VM formation in the blank group showed good tubular morphology. The number of VM in the low dose group of Qi-lan capsule was slightly less than that in the blank control group, and the lumen channel formation was acceptable. In the medium and high dose group, only a very small amount of straight channel formation was visible.ConclusionQi-lan capsule can effectively control the formation of VM in prostate cancer. VM was suppressed more markedly as dose increased.

Qi-lan capsule; prostatic neoplasm; vasculogenic mimicry; Dose-Response Relationship, Drug

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.03.005

R 737.25

资助：国家自然科学基金青年基金项目（81503589）；四川省教育厅科技项目（14ZB0089）；四川省中医药管理局重大疑难疾病防治研究项目（项目批准号：2012-A-095）

**通讯作者，E-mail: wusu5356@163.com