远端肢体缺血预处理脑保护作用机制研究进展

万雅琦综述， 吴世政审校

远端肢体缺血预处理脑保护作用机制研究进展

万雅琦1综述， 吴世政2审校

远端肢体缺血预处理(remote limb ischemic preconditioning，LRP，RLIP)是指通过间断的非致死量的远端肢体缺血刺激来诱导大脑的缺血耐受，从而在后期脑缺血事件中尽可能的保护神经元，减少神经细胞凋亡及坏死，减轻脑水肿，改善预后的一种干预措施[1～4]早在1945年时，便已经有科学家提出缺氧耐受的理论，认为在组织器官缺血、缺氧事件发生前后对机体进行一定的处理能够调动细胞内外的应急系统，从而在缺血、缺氧性事件中为受损脏器提供一定的保护效应[5]，自此掀起了预处理的研究热潮。其后又先后有科学家发现，某一脏器的缺血性损伤(心脏、肠、肝脏、肾脏)，降低了患其他脏器(心脏、脑等)缺血性事件的发生概率以及严重程度[6～8]。人们又将远端缺血器官延伸到肢体上，从而大大减少了预处理的损伤程度，还可以通过无创袖带加压法阻断血流等此类无创方式实施预处理，简便易行。

目前国内外已经有大量有关远端肢体缺血预处理的神经保护作用研究。而这一保护作用在临床上也有相应的证据证明其存在，Connolly等[9]通过搜集有关病例发现既往患周围血管栓塞性疾病未进行治疗的患者其心脑事件发生后的功能障碍要低于经过治疗的的患者，也就是说肢体的慢性缺血是能够调动机体的保护机制激活，从而减轻脑缺血后神经系统的损伤。Oh等[10]通过临床研究发现给拟行髋关节置换术的患者给予肢体止血带加压缺血预处理后，能够大大增加术后脑区域氧饱和度及肺内氧合能力，同时还能降低血液内炎症因子及乳酸脱氢酶水平。

1 远端肢体缺血预处理的模型制作

动物实验中远端肢体缺血预处理的模型制作方式以及缺血、再灌时间各异，但主要为有创和无创两类，又可分为双侧缺血与单侧缺血两种：

1.1 单侧肢体缺血(一般选取左后肢) 无创RLIP 模型：用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，自制的血压计袖袋缠住单侧后肢的根部，加压阻断股动脉(+)：加压后该肢体脉搏消失、体温下降、发绀，持续5 min；减压，脉搏出现、体温回升、皮肤潮红，为再灌注的标志，持续5 min，共3个循环[11]。这一方法的优点是创伤小、大鼠的存活率高、不影响神经功能评分，缺点是缺血程度较为主观，没有有创性的夹闭股动脉可控性高，结合袖带血压血流测量仪可以有效改善这一缺点。

有创模型：分离左下肢股动脉，动脉夹夹闭15 min，恢复再灌15 min，反复3个循环[12]。该方法虽然能够保持组内每只动物缺血程度的基本一致，却因其创伤较大，影响后期存活率及神经功能缺损程度的判断。

1.2 双侧肢体缺血 在距股动脉根部远心端大约3 mm左右位置动脉夹夹闭双侧股动脉，进行5 min断流，5 min再灌的循环共3次。夹闭动脉后观察肌肉颜色变化，皮肤温度降低，回复血流时温度升高，皮肤变红润，表示造模成功[13]。同样，该种方法为有创操作，相比单侧而言对实验动物的损伤更大，但双侧缺血与单侧缺血相比是否预处理效果更佳，保护效应更明显，目前尚缺乏有效的实验数据来说明，还需要进一步验证。

1.3 腹主动脉血流阻断 沿大鼠腹正中切口切开，温盐水纱布包裹后轻轻拨开肠管，打开后腹膜，钝性分离腹主动脉与下腔静脉，于腹主动脉与左右髂总动脉分叉处，将一塑料软管与血管并行放置，穿一根手术用丝线阻断腹主动脉血流(或使用动脉夹代替以上繁琐步骤)10 min，恢复血流10 min共重复3次[14]。

关于上下肢缺血预处理效果是否有差异，目前尚无相关研究证明。三类方法均能够有效复制远端肢体缺血预处理模型，实验者可根据具体实验室条件及实验设计合理选择，就目前来说，无创袖带加压法最为理想，避免了肢体损伤干扰的后期神经功能评分的准确度，但需要用到动物血压监测仪，肉眼判断组织温度及颜色变化会存在一定的人为因素干扰。直接手术动脉夹夹闭法的缺血效应最为精准，可以控制，但是由于肢体的损伤，可能会影响神经功能的判断，因而在手术过程中要尽量减少组织损伤，手术切口尽可能小。

2 参与远端缺血预处理的时间窗

脑缺血耐受主要分为两个阶段，早期快速缺血耐受阶段(缺预处理后30～60 min)，第二阶段迟发性保护作用阶段(24～72 h)。因而绝大多数的研究也就围绕在这两个时间段进行，一般认为，超过72 h预处理的保护作用便不再明显，可能与损伤性因素的加剧，炎症级联反应的出现有关，也可能是由于保护性因子、蛋白的耗竭或分解[15]。

3 参与远端肢体缺血预处理神经保护作用的可能机制

目前以高致死率致残率占据世界高危疾病前三的缺血性脑卒中是神经系统疾病防治工作中的重点研究对象[16]，并且有着年轻化的趋势，不单单只是中老年高发病，一些青壮年，甚至儿童病例的发现也在不断向人们敲响警钟——脑损伤的防治研究迫在眉睫，而远端缺血预处理是各大研究中非常有发展前景的一项。关于远端肢体缺血预处理的可能机制，目前国际公认的有神经、体液、免疫相关途径三条主要途径，(1)神经因素：神经节阻断剂能够一定程度上降低预处理所起到的神经保护作用，在切断大鼠双侧坐骨神经后，远端肢体缺血预处理的神经保护作用也就不再明显[17]。(2)体液途径：远端缺血预处理后，体内的某些因子通过血液循环带到脑组织中，启动脑缺血耐受。(3)免疫因素：预处理能够抑制系统炎症，临床研究发现，基因芯片技术分析既往存在短暂性肢体缺血性疾病的志愿者血浆，促炎因子相关基因减少，抗炎因子基因增加；预处理能降低健康成年男性血液中中性粒细胞活性，减少中性粒细胞粘附至血管内皮的功能，改善外周免疫细胞功能及数目[18]。

此外，尚有三者共同起作用的共同通路学说也在远端肢体缺氧预处理的神经保护机制中占据一席之地，该学说认为：神经因素、体液因素以及免疫因素在远端肢体缺血预处理对脑缺血的作用并非是单一的，而是相互影响，共同起作用的，当然也不排除有其他因素的参与。这些调节都能够引起细胞内外某些分子的数目、结构、功能以及分布的变化，从而引起相应的生物学效应。其中就包括：炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α、过氧化物、凋亡及细胞自噬相关蛋白，内皮因子。

目前参与远端肢体缺血预处理所引起脑缺血耐受的有关分子及信号通路主要有以下几种：

(1) 信号分子

①血管内皮生长因子：文雅惠等人[19]发现肢体缺血预处理减少了大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型脑组织血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板源性生长因子B(platelet-derived growth factor B，PDGF-B)含量，认为此保护作用与血管再生有关系。

②水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)：有学者认为，LRP能通过下调AQP4来改善神经功能[20]，但同时有相反的观点指出LRP对DWI中梗死灶范围的控制与AQP4的上调有关[12]。

③脑红蛋白表达：Ran等人[21]发现远端肢体预处理能够改善复苏后大鼠脑功能受损情况，在预处理前给予脑红蛋白反义寡核苷酸后，脑组织内的脑红蛋白含量下降，预处理所带来的神经功能改善作用没有之前明显。

(2) 信号通路

①P38/MAPK 信号通路：RLIP 对大鼠脑损伤的保护作用可能与p38MAPK信号通路活性的降低有关，Caspase8 和Caspase3 表达降低，从而抑制神经细胞凋亡。短时间的脑组织缺血可以诱导脑组织对的缺血、缺氧的耐受性。其原因可能是较短时间内亚致死性缺血引起的脑组织内磷酸化p38的表达较晚，而再灌注数小时后表达才缓慢增强，且表达的量较少。免疫组织化学结果显示，给予远端肢体缺血预处理后，p38MAPK信号通路活性明显降低，Caspase 8 蛋白和Caspse 3 蛋白表达下降，海马CA1区神经细胞凋亡减少，提示RIPC可能通过降低p38MAPK信号通路的活性抑制神经细胞凋亡发挥脑保护作用[11]。

②Notch信号通路：预处理后Notch信号表达降低，但随着时间变化，表达有所改变，后期对照组表达下降而预处理组表达逐渐增强[22]。

③JAK-STAT3信号通路：远端肢体缺血预处理MCAO大鼠脑梗面积减小是通过JAK-STAT3信号通路上调Bcl-2蛋白，下调Bax蛋白，抑制细胞凋亡来实现的[23]。

④其他信号通路：董文帅等人[24]通过基因芯片技术检测远端缺血预处理大鼠脑组织半暗带基因表达情况发现以下通路与远端缺血预处理的神经保护作用有关：JAK-STAT通路、P53信号通路、MAPK信号通路、谷氨酸突触信号通路、血管内皮生长因子信号通路等多条信号通路。

4 其它可能机制

预处理上调nNOS(神经源性一氧化氮合酶)，调动nNOs 水平升高，并且与p-ERK 密切相关，此外，血管内皮系统NOS的合成增加及其潜在的PI3K/Akt信号通路的激活起到神经保护作用，该酶的抑制剂能够部分阻断预处理所带来的神经保护作用。远端肢体缺血后处理也能参与到后处理的保护作用机制当中，这为预处理的机制探讨提供了线索[25]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)RIPC的作用可能是通过磷酸化的mTOR 实现，许多研究发现mTOR 可调节蛋白合成，通过促进血管生成及神经再生，促进神经修复，mTOR 抑制可能导致细胞自噬或凋亡。死亡受体CD95 的刺激可活化PI3K/AKT/mTOR 信号通路，增加蛋白表达及神经干细胞存活率[26]，给远端肢体缺血预处理的机制探讨又提供了一个新的方向。但近年来也有人发现远端缺血并未改变血液中细胞外超氧化物歧化酶及谷胱甘肽过氧化物酶这类脑损伤性物质的含量，一定程度上否认了预处理与抗氧化物质改变之间的关系，这也提示我们远端缺血预处理的最终效应是有益的还是不利的，可能取决于缺血时间及程度的大小。

当前有关远端肢体缺血预处理的效应以神经保护作用的研究结论居多，而脑损伤的核心是小胶质细胞的激活，虽然目前已经有远端缺血后处理通过提前激活小胶质细胞诱导免疫耐受的研究，但是有关预处理通过激活小胶质细胞相关通路诱导缺血耐受的研究尚少，我们接下来可以此为切入点探索远端缺血预处理神经保护作用的机制。由于仍然存在相当一部分观点否认远端缺血预处理对脏器的保护作用[27]，远端缺血预处理与脑保护作用之间的关系到底如何，具体机制是什么，最先启动的信号分子是哪些目前还需要大量的实验结果来支持。

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2017-01-16；

2017-03-20 作者单位：(1.青海大学医学院，青海 西宁 810000 2.青海省人民医院神经内科，青海 西宁 810000)

吴世政，E-mail：wushizheng2005@hotmail.com

1003-2754(2017)05-0469-03

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