八宝丹处理肺腺癌细胞A549和SPCA-1对顺铂化疗敏感性的影响*

成 瑜 李洪伦

1 青岛大学附属烟台毓璜顶医院肿瘤内科 烟台 264000；2 青岛大学附属烟台毓璜顶医院影像中心



八宝丹处理肺腺癌细胞A549和SPCA-1对顺铂化疗敏感性的影响*

成 瑜1李洪伦2

1 青岛大学附属烟台毓璜顶医院肿瘤内科 烟台 264000；2 青岛大学附属烟台毓璜顶医院影像中心

目的 探讨八宝丹处理人肺腺癌A549和SPCA-1细胞系对顺铂(DDP)抗肿瘤化疗敏感性影响。方法 收集人肺腺癌A549和SPCA-1细胞系进行不同处理，随机分为对照组(空白)、DDP组(4 uM)、(八宝丹+DDP)组(0.75 mg/kg+4 uM)，处理3周，采用MTT法检测细胞增殖能力；末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记测定(TUNEL)法检测细胞凋亡率，采用transwell检测细胞迁移能力。结果 与对照组比较，DDP组和(八宝丹+DDP)组的A549和SPCA-1细胞增殖能力明显降低(P<0.01)；与DDP组比较，(八宝丹+DDP)组的A549和SPCA-1细胞增殖能力无明显差异(P>0.05)。与对照组比较，DDP组和(八宝丹+DDP)组的A549和SPCA-1细胞凋亡明显增加(P<0.01)；与DDP组比较，(八宝丹+DDP)组的A549和SPCA-1细胞凋亡明显增加(P<0.05)。与对照组比较，DDP组和(八宝丹+DDP)组的A549和SPCA-1细胞迁移数目明显降低(P<0.01)；与DDP组比较，(八宝丹+DDP)组的A549和SPCA-1细胞迁移数目明显降低(P<0.001)。结论 (八宝丹+DDP)可以增加肿瘤细胞的凋亡，降低肿瘤细胞的增殖，减少A549和SPCA-1细胞迁移数目，增加肿瘤细胞的DDP抗肿瘤敏感性。

肺腺癌；八宝丹；顺铂；化疗敏感性

肿瘤目前仍是严重威胁人类健康的疾病之一，据世界卫生组织( WHO)统计，2008年全球有1240万人被新检查出患有癌症，760万人死于癌症．顺铂是第一代铂类抗肿瘤药物，具有抗癌谱广、作用机制独特、利于临床联合用药等特点．在临床上顺铂对肺癌、胃癌、头颈部肿瘤、骨肉瘤等实体肿瘤的治疗取得了很好的效果[1-2]。但是顺铂在治疗过程中具有副作用多、毒性大等缺点，因此寻找高效低毒的肿瘤化疗增敏剂以增强顺铂的化疗效果，提高患者的生存率是一项重要的课题。八宝丹具有清利湿热、活血解毒、去黄止痛的功效，辅助抗菌、调节机体免疫功能[3-4]，长期服用可以减轻化疗药物的毒副作用。而将其用于人肺腺癌A549和SPCA-1细胞系对DDP化疗敏感性的研究并不多见，本研究通过采用八宝丹处理人肺腺癌A549和SPCA-1细胞系从而观察八宝丹对DDP在肺腺癌A549和SPCA-1细胞系中化疗作用的影响，证实八宝丹在抗肿瘤治疗中能提高对DDP化疗敏感性的作用。

1 材料与方法

1.1 实验药品 A549细胞系，SPCA-1细胞(上海华瑞生物科技有限公提供)；DMEM培养基(Gibco)，96孔板细胞培养板(NEST，Cat.No.PPP-001-030)；细胞培养试剂：胎牛血清(Hyclone，Cat.No.SH30087.01)，RPMI-1640培养基(Gibco)，PBS磷酸钾缓冲液(Hyclone，Cat.No.SH30256.01B)，DMSO，TUNEL BrightGreen Apoptosis Detection Kit(Vazyme，A112-02) ，DAPI(碧云天)。八宝丹胶囊(厦门中药厂有限公司生产，国药准字Z10940006，0.75 mg/kg)，顺铂(云南生物谷药业股份有限公司生产，国药准字H20043888，4 uM),其余为国产分析纯。

1.2 实验分组及处理 收集肺腺癌细胞A549和SPCA-1，根据处理的药物不同，DDP单药及八宝丹联合DDP进行处理，随机分为对照组(空白)、DDP组(4 uM)、(八宝丹+DDP)组(0.75 mg/kg+4 uM)，分别进行相应的处理。

1.3 仪器 酶标仪(Thermo Fisher Scientific生产，型号：multiscan MK3)；恒温细胞培养箱(Thermo HERACELL150i)；倒置生物显微镜(OPTEC BDS200-PH)；Transwell细胞培养板(Corning 3422)；倒置光学显微镜(OLYMPUS CKX41,U-CTR30-2)；细胞恒温培养箱(Thermo scientific, HERACELL150i)。

1.4 Transwell检测细胞迁移能力[5]取对数生长期的细胞，无血清DMEM培养基重悬,计数，调整细胞密度为1×106/mL个细胞，加入100 uL无血清DMEM培养基细胞悬液，加入Transwell小室上室，在下室加入600 uL完全培养基。在37℃,5%CO2孵育24小时后，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4%多聚甲醛固定15min，PBS洗涤一次，结晶紫染色10min，PBS洗涤一次，检测细胞是否穿过小孔，如有穿过终止其他实验组，并拍照统计。

1.5 MTT法检测细胞增殖能力[6]取同一批分离的心肌微血管内皮细胞，接种于24孔板，每组设4个复孔。按1.2和1.3方法进行分组及造模。复氧结束后，加20 μL MTT培养4 h，待结晶物溶解，采用酶标仪在波长492 nm处检测各组的吸光度(A)值作为细胞增殖能力。

1.6 TUNEL检测细胞凋亡[7]收集活细胞，按照TUNEL试剂盒的说明书进行操作，制备好后在荧光显微镜下进行观察，绿色荧光为细胞凋亡。采用DAPI对细胞核进行染色，对呈蓝色荧光每张选取10个视野进行计数，试验组的计数为80个视野，统计内皮细胞总数和凋亡细胞数。细胞凋亡率=TUNEL阳性细胞/总细胞数×100%。

2 结果

2.1 MTT法检测细胞增殖能力的结果 具体见表1，由表1可知与对照组比较，DDP组和(八宝丹+DDP)组的A549和SPCA-1细胞增殖能力明显降低(P<0.01)；与DDP组比较，(八宝丹+DDP)组的A549和SPCA-1细胞增殖能力没有明显差异(P>0.05)。

表1 MTT法检测细胞增殖能力的结果±s，OD值)

注：与对照组比较，*P<0.01。

2.2 细胞凋亡的结果 具体结果见图1为A549和SPCA-1的细胞凋亡图。由图1可知与对照组比较，DDP组和(八宝丹+DDP)组的A549和SPCA-1细胞凋亡均明显增加(P<0.01)；与DDP组比较，(八宝丹+DDP)组的A549和SPCA-1细胞凋亡明显增加(P<0.05)。

2.3 细胞迁移结果 A549和SPCA-1细胞迁移数目见图2和表2，由图2和表2可知与对照组比较，DDP组和(八宝丹+DDP)组的A549和SPCA-1细胞迁移数目明显降低(P<0.01)；与DDP组比较，(八宝丹+DDP)组的A549和SPCA-1细胞迁移数目明显降低(P<0.001)。

分组A549SPCA⁃1对照组135．6±20．5253．3±25．6DPP组106．3±22．3∗123．7±26．3∗(八宝丹+DDP)组20．0±5．9∗#45．3±12．1∗#

注：与对照组比较，*P<0.001；与DDP组比较，#P<0.001。

3 讨论

八宝丹的主要成分是牛黄、蛇胆、羚羊角、珍珠、三七、麝香等。药理学研究表明三七可增强免疫活性、保肝利胆、抗炎消肿、缓解各种疼痛[8]；牛黄可调节肿瘤患者的免疫机能、诱发细胞凋亡[9]；蛇胆、羚羊角、珍珠、麝香可改善血液循环，具有抗氧化及抗炎作用[10]。有研究[11，12]显示恶性肿瘤患者在化疗的过程中长期服用八宝丹可以减少化疗药物的毒副作用，延长患者的生存时间。但是将其应用于人肺腺癌A549和SPCA-1细胞系对顺铂化疗敏感性的研究并不多见，而且八宝丹是否可以起到降低顺铂化疗敏感性的作用，也是本研究需要研究的内容。

顺铂是临床上用于治疗恶性肿瘤的一线药物，其作用机制是通过直接作用于肿瘤细胞的DNA，破坏肿瘤细胞的DNA，从而抑制肿瘤细胞的增殖。八宝丹是一种中成药，可以多靶点、整体调节患者机体，在一定程度上可以降低铂类药物的毒副作用。有研究[13]报道中药及其组方制剂可以对铂类药物的毒副作用起到预防和减轻的作用，而且其中部分中药可以增强铂类药物抗肿瘤的效果。而关于八宝丹与顺铂的联合能否增强顺铂的化疗效果，国内尚未见报道。有研究认为多种中药可以对肿瘤细胞的增殖有抑制作用，对肿瘤细胞有一定的杀伤作用，并对顺铂的耐药可起到一定的逆转作用[14]，使肿瘤的耐药细胞迅速凋亡，提高顺铂的药效，并减少对患者的毒副作用。

本研究通过八宝丹联合顺铂对人肺腺癌A549和SPCA-1细胞系的处理，分别对顺铂、八宝丹+顺铂对人肺腺癌A549和SPCA-1细胞的凋亡、细胞增殖及A549和SPCA-1的细胞迁移情况进行了分析，结果显示A549的细胞增殖能力明显高于SPCA-1细胞增殖能力，但是八宝丹+顺铂处理后A549和SPCA-1细胞的增殖能力显著低于对照组，但与顺铂处理组的肿瘤细胞无明显差异；通过八宝丹+顺铂处理后A549和SPCA-1细胞的凋亡较顺铂单药组明显增加；经过八宝丹+DDP处理的A549和SPCA-1细胞迁移数目均要比顺铂处理的少。结果表明经八宝丹处理后的肿瘤细胞增殖能力降低，凋亡增加，细胞迁移数目减少。可见八宝丹能增强DDP化疗敏感性，提高顺铂的化疗效果。

综上所述，八宝丹+DDP可以增加癌细胞的凋亡，降低A549和SPCA-1细胞迁移数目，增强肿瘤细胞的DDP化疗敏感性。

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Effect on sensitivity to cisplatin after Babaodan treatment of human lung adenocarcinoma cells A549 and SPCA-1

CHENG Yu1LI Honglun2

1 Department of Medical Imaging,Affiliated Yantai Yuhuangding Hospital of Qingdao University,Yantai,264000,P.R.China 2 Department of Medical Oncology,Affiliated Yantai Yuhuangding Hospital of Qingdao University

Objective To study the babaodan treatment of human lung adenocarcinoma cell line A549 and line SPCA-1 to cisplatin (DDP) chemotherapy sensitivity.Methods Collected human lung adenocarcinoma A549 and SPCA-1 cell lines for different treatment,were randomly divided to control group (or not),DDP group (4 UM),babaodan DDP group (0.75 mg/kg+4 UM),treatment was 3 weeks,used MTT assay to detect the ability of cell proliferation,used terminal deoxynucleotidyl transfer enzyme mediated D UTP nick end labeling determination (TUNEL) method to detect apoptosis rate, used Transwell assay to detect the ability of cell migration.Results Compared with the control group,the A549 and SPCA-1 cell proliferation of DDP group and babaodan+DDP group decreased significantly (P<0.01);compared with the DDP group,the A549 and SPCA-1 cell proliferation of babaodan+DDP group had no significant difference (P>0.05).And compared to the control group,the DDP group and babaodan+DDP group of A549 and SPC-A-1 cells apoptosis increased significantly (P<0.01);compared with the DDP group,babaodan+DDP group on A549 and SPC-A-1 cells apoptosis increased significantly (P<0.05).And compared to the control group,A549 and SPC-A-1 cell migration number of DDP group and babaodan+DDP group decreased significantly (P<0.01);compared with the DDP group,babaodan+DDP group on A549 and SPC-A-1 cell migration number decreased significantly (P<0.001).Conclusion Babaodan DDP can increase the apoptosis of cancer cells,reduces the proliferation of cancer cells,reduces cells and the number of migrated of the A549 and SPC-A-1, and enhances the chemotheropy sensitivity of DDP.

lung adenocarcinoma;babaodan;cisplatin;chemotheropy sensitivity

烟台市发展计划项目(2012092)

李洪伦，Email:liubaodong123@yeah.net

R734.2

A

1001-9510(2016)06-0414-04

2016-06-12)