HT22细胞氧糖剥夺再灌注及Grasp65过表达干预后高尔基体的形态变化及其可能机制研究

王 佳， 熊 炬， 周文胜



HT22细胞氧糖剥夺再灌注及Grasp65过表达干预后高尔基体的形态变化及其可能机制研究

王 佳1， 熊 炬2， 周文胜2

目的 探讨HT22细胞氧糖剥夺再灌注及Grasp65过表达干预后高尔基体的形态变化及其可能机制。方法 利用小鼠海马神经元细胞系HT22为研究对象，HT22细胞经氧糖剥夺再灌注损伤及Grasp65过表达干预后，采用MTT法检测细胞存活率；Hoechest33258荧光染色法评估细胞凋亡；并应用细胞免疫荧光技术观察高尔基体的形态；应用Western blot技术检测GM130和GAAP蛋白的表达。结果 氧糖剥夺再灌注可导致HT22细胞的活性显著降低(P<0.05)，凋亡率显著增高(P<0.05)；并可导致高尔基体形态的异常，随着再灌注时间的延长，高尔基体逐渐发生碎裂，尤其以再灌注12 h和24 h最为明显；GM130、GAAP的表达水平在氧糖剥夺再灌注后出现下降，特别是在再灌注12 h、24 h后出现了显著下降(P<0.05)。过表达Grasp65后，HT22细胞在氧糖剥夺再灌注所致高尔基体碎裂出现减少(P<0.05)，碎裂程度减轻，同时GM130和GAAP的表达均显著增加(P<0.05)，HT22细胞的存活率大大提高(P<0.05)，凋亡率显著降低(P<0.05)。结论 缺血再灌注损伤的细胞模型中，同样发生了高尔基体的碎裂；过表达Grasp65可以减轻氧糖剥夺再灌注损伤所致的高尔基体碎裂，并可以减少HT22细胞的凋亡，其机制可能与上调GM130和GAAP的表达有关。

高尔基体碎裂； 凋亡； 小鼠海马神经元系HT22； Grasp65； GM130

脑梗死是临床上较为常见的疾病，其发病率、致残率及死亡率均高，缺血再灌注损伤是造成脑梗死的重要原因。近年来许多研究发现，在多种神经系统疾病如阿尔茨海默病(AD)、帕金森氏病(PD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)等病理神经元中发现了高尔基体形态的改变，甚至碎裂的现象[1～3]。对此现象深入研究发现，高尔基体可能是细胞内死亡信号途径的重要感受者与放大者，在细胞凋亡早期即核染色体DNA还未改变之前，已出现了高尔基体形态的变化，说明高尔基体在细胞凋亡过程中起重要的早期启动作用[4]。另外研究表明，在脑缺血再灌注的动物模型中也发现了高尔基体的碎裂[5]。但是在缺血再灌注损伤的细胞模型中，是否同样发生了高尔基体碎裂？通过阻止高尔基体碎裂是否可以减轻神经元细胞的凋亡，改善神经功能尚不清楚。因此，研究高尔基体凋亡的信号转导机制对神经元凋亡的影响十分重要。

Grasp65是一类重要的高尔基体相关蛋白，对维持高尔基体的形态和功能具有重要作用，如参与细胞分裂间期高尔基体解聚、裂解以及细胞凋亡中的高尔基体碎裂[6,7]。既往有多项研究表明转染Grasp65和表达Grasp65突变体可减少高尔基体碎裂[4,8]。本研究利用小鼠海马神经元细胞系HT22建立缺血再灌注损伤的细胞模型，探讨HT22细胞氧糖剥夺再灌注及Grasp65过表达干预后高尔基体的形态变化及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠海马神经元细胞系HT22(本研究所保存)；胎牛血清(Gemini公司)；高糖DMEM培养基和无糖DMEM培养基(Kccell公司)；Hoechest33258(Sigma公司)；MTT(Sigma公司)；pcDNA3.1-Grasp65 过表达载体(本研究所构建与保存)；Lipofectamin3000转染试剂(Invitrogen公司)；GM130抗体(Abcam公司)；GAAP抗体(Santa cruz公司)；β-tubulin抗体(联科生物)；β-actin抗体(Proteintech公司)；二抗和荧光二抗(Proteintech公司)；ECL超敏发光液和PVDF膜(Millipore公司)；DAPI(碧云天生物有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养、分组及氧糖剥夺再灌注(OGD/R)损伤模型建立 用含有10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养基，在5%CO2、37 ℃恒温恒湿培养箱培养HT22细胞。待细胞融合至80%～90%即可传代，取细胞形态良好、对数增殖期培养的细胞用于后续实验。实验分为模型组(OGD/R组)、空载模型组(pcDNA3.1+OGD/R组)、Grasp65过表达干预组(Grasp65+OGD/R组)，每组再按再灌注时间点不同分为6 h、12 h、24 h 3个亚组。参照文献[9]建立HT22细胞OGD/R损伤模型：首先用无糖DMEM培养基冲洗细胞3次，替换掉完全培养基，放置于含1%O2、5%CO2、94%N2的三气培养箱中缺氧缺糖培养6 h，然后将培养基替换为完全培养基，放置于37 ℃、5%CO2常规培养箱中复氧培养，分别继续培养6 h、12 h、24 h。

1.2.2 MTT检测细胞存活率 各组HT22细胞加入100 L溶解于DMEM的MTT溶液(0.5 mg/ml)，在培养箱中孵育4 h，弃掉培养液，加入100 L DMSO溶液，37 ℃振荡10 min，用酶标仪检测细胞在490 nm处的吸光度(A)值。用每组A值与空白对照组A值的比值来计算细胞存活率，实验重复4次，最后取平均值。

1.2.3 Hoechst 33258检测细胞凋亡率 各组HT22细胞加入Hoechest 33258溶液(5 μg/ml)，37 ℃孵育10 min。抗荧光淬灭剂封片，避光，荧光显微镜观察拍片。随机选取3个高倍视野，计算每个视野细胞凋亡率(凋亡细胞数/总细胞数×100%)。

1.2.4 Western blot检测GM130、GAAP的蛋白表达 收集各组HT22细胞，使用蛋白提取试剂盒提取总蛋白，测量其蛋白浓度。蛋白变性后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用半干转移法将凝胶电泳分离的蛋白分子转移到 PVDF膜上。5%牛血清白蛋白室温封闭1 h，加入相应一抗，抗GM130(1∶1000)、GAAP(1∶100)、β-actin(1∶4000)，4 ℃孵育过夜。用TBST洗3次，每次10 min。加入相应二抗37 ℃孵育1 h，TBST漂洗4次，ECL显影和采图。Quantity one软件分析各条带吸光度值，计算相对表达量。实验重复3次，取均值做统计学分析。

1.2.5 细胞免疫荧光观察高尔基体(用GM130标记)的形态变化 各组HT22细胞经4%多聚甲醛室温固定后，经0.5% tritonX-100通透30 min，用兔源GM130单抗(1∶100)和小鼠源β-tubulin单抗(1∶200)4 ℃孵育过夜，PBS洗，FITC山羊抗兔和Alex Fuor 595山羊抗小鼠荧光二抗室温孵育1 h，PBS洗，用含DAPI的封片剂封片，奥林巴斯荧光倒置显微镜电脑采像。

2 结 果

2.1 氧糖剥夺再灌注及Grasp65过表达干预对HT22细胞活性的影响 模型组、空载模型组和Grasp65过表达干预组HT22细胞经氧糖剥夺6 h再灌注6 h、12 h、24 h后，HT22细胞活性显著降低，与正常组比较有统计学差异(P<0.05)；Grasp65过表达干预组与模型组相比，HT22细胞存活率有所上升，其中再灌注6 h、12 h细胞活性有显著差异(P<0.05)，24 h细胞活性无明显差异(P>0.05)；空载模型组与模型组比较无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

2.2 氧糖剥夺再灌注及Grasp65过表达干预对HT22细胞凋亡的影响 正常组细胞核形状正常，呈圆形，显淡蓝色荧光，其核内染色质均匀分布，无明显凋亡细胞；模型组细胞随着再灌注时间的延长，逐渐可见部分细胞胞体缩小，胞浆浓缩，染色质分布不均，再灌注12 h、24 h细胞核致密浓染，显亮蓝色，细胞核碎裂呈碎片状，再灌注24 h可见凋亡细胞增多，细胞出现坏死，细胞轮廓不清，已解体；过表达Grasp65后，氧糖剥夺再灌注所致凋亡细胞减少(见图1A)。模型组、空载模型组和Grasp65过表达干预组HT22细胞经氧糖剥夺6 h再灌注6 h、12 h、24 h后，HT22细胞凋亡率显著上升，与正常组比较有统计学差异(P<0.05)；各个时间点Grasp65过表达干预组与模型组相比，HT22细胞凋亡率下降显著(P<0.05)；空载模型组与模型组比较无统计学意义(P>0.05)(见图1B)。

2.3 氧糖剥夺再灌注及Grasp65过表达干预对HT22细胞高尔基体形态的影响 通过GM130标记高尔基体，β-Tubulin标记细胞微管结构，以观察氧糖剥夺再灌注后高尔基体的形态变化。免疫荧光结果显示，在正常组中，HT22细胞内高尔基体结构紧密，聚集于核边，不分散；氧糖剥夺6 h再灌注6 h后，部分细胞的高尔基体结构较正常组稍松散，可见少量碎裂片段；再灌注12 h、24 h后，大部分细胞内高尔基体的正常形态被破坏，囊膜碎裂明显，可见明显的碎裂片段或颗粒广泛散在细胞内(见图2)。Grasp65过表达干预后，未遭受氧糖剥夺的HT22细胞内高尔基体形态正常，结构紧凑，不分散；氧糖剥夺6 h再灌注6 h、12 h后，高尔基体形态基本正常，但结构稍显松散，稍见条形块状碎片，与同期模型组比较，高尔基体碎裂程度有所改善；再灌注24 h后，约一半细胞内高尔基体出现体积扩大，囊膜结构碎裂成颗粒状分散在细胞中，但与同期模型组比较，高尔基体碎裂程度也有所减轻(见图3)。我们发现，空载模型组各时间点高尔基体的碎裂与同期模型组比较均无统计学意义(P>0.05)；过表达Grasp65后HT22细胞在氧糖剥夺再灌注6 h后的高尔基体的碎裂较同期模型组有所减少，但差异不具有统计学意义(P>0.05)；而在再灌注12 h、24 h后高尔基体的碎裂较同期模型组明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)(见图4)。

2.4 氧糖剥夺再灌注及Grasp65过表达干预对HT22细胞GM130、GAAP蛋白表达的影响 与正常组比较，HT22细胞经氧糖剥夺6 h再灌注6 h后，细胞内GM130和GAAP的表达无明显变化，差异不具有统计学意义(P>0.05)；随着再灌注时间的延长，GM130和GAAP在再灌注12 h和24 h的表达均较正常组出现了显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。Grasp65过表达干预后，氧糖剥夺再灌注6 h、12 h的GM130的表达与正常组基本一致(P>0.05)，而24 h的GM130的表达较正常组显著下降(P<0.05)；Grasp65过表达干预后，氧糖剥夺再灌注6 h的GAAP的表达与正常组基本一致(P>0.05)，而12 h、24 h的GAAP的表达较正常组显著下降(P<0.05)；Grasp65过表达干预组各时间点GM130和GAAP的表达较同期模型组出现了显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)(见图5)。

表1 OGD/R及Grasp65过表达干预对HT22细胞活性的影响

与正常组比较*P<0.05；与模型组比较#P<0.05

A：Hoechst33258凋亡染色(×400)；B：各组凋亡率统计分析,与正常组比较*P<0.05；与OGD/R比较#P<0.05

图1 OGD/R及Grasp65过表达干预对HT22细胞凋亡的影响

图2 OGD/R对HT22细胞内高尔基体形态的影响(×400)

图3 过表达Grasp65后OGD/R对HT22细胞内高尔基体形态的影响(×400)

与正常组比较*P<0.05；与OGD/R比较#P<0.05

图4 OGD/R及Grasp65过表达干预对HT22细胞高尔基体碎裂的统计分析

A：Western blot 检测HT22细胞在OGD/R后各时间点GM130、GAAP的表达；B：Western blot 检测过表达Grasp65后HT22细胞在OGD/R后各时间点GM130、GAAP的表达；C：GM130表达量变化的统计分析；D：GAAP表达量变化的统计分析；与正常组比较*P<0.05；与OGD/R比较#P<0.05

图5 OGD/R及Grasp65过表达干预对GM130、GAAP表达的影响

3 讨 论

脑缺血后恢复血液再灌注可以减轻部分缺血神经元的损伤，但同时也会加重部分缺血细胞的损伤，甚至导致这些细胞的死亡，对中枢神经系统功能产生严重的影响。因此，从全新的角度探索和研发新的药物，促进脑缺血再灌注损伤后神经系统功能的改善或恢复，成为近年来研究脑梗死的重点之一。

现在越来越多的研究从细胞器水平来分析神经系统疾病的病变过程和病理特点，有证据表明高尔基体涉及到神经系统疾病的发病机制中[10,11]。本研究利用小鼠海马神经元细胞系HT22建立缺血再灌注损伤的细胞模型，通过对HT22细胞氧糖剥夺6 h再灌注6 h、12 h、24 h后发现，氧糖剥夺再灌注可导致神经元细胞的活性显著降低，凋亡率显著上升，且随着再灌注时间的延长，上述损伤表现逐渐加重，这种变化规则基本符合缺血再灌注损伤的病理生理特点。氧糖剥夺再灌注可导致HT22细胞高尔基体形态的异常，随着再灌注时间的延长，高尔基体逐渐发生碎裂，呈长条状或颗粒状，尤其以再灌注12 h和24 h最为明显。因此，我们认为，与缺血缺氧损伤相比，再灌注损伤对高尔基体的打击更大，即高尔基体可能不能耐受再灌注损伤的打击。GM130是维持高尔基体结构和形态完整的重要蛋白[12]。我们的实验发现，GM130的表达水平在氧糖剥夺再灌注后出现下降，特别是在再灌注12 h、24 h后，GM130出现显著的下降，并在这两个时间点观察到了大量的HT22细胞内高尔基体发生了严重的碎裂。因此，我们有理由相信，氧糖剥夺再灌注所致HT22细胞内高尔基体的碎裂可能与GM130表达水平的下降有关。GAAP是一种定位于高尔基体的抗凋亡蛋白[13]。

本研究发现，在氧糖剥夺再灌注初期，GAAP的表达水平基本没有变化，而此时高尔基体的形态基本保持正常，但是从再灌注12 h开始，GAAP的表达水平急剧下降，同时高尔基体发生了明显的颗粒状碎裂。因此，我们推测GAAP蛋白可能仅在氧糖剥夺再灌注早期发挥了一定的抗凋亡作用，GAAP蛋白表达水平的下降可能也是导致高尔基体碎裂的原因之一。

氧糖剥夺再灌注损伤引起高尔基体的碎裂，有可能对蛋白加工成熟、囊泡运输以及钙离子稳态产生影响，从而诱导缺血的神经细胞发生死亡或凋亡。故若能从抑制高尔基体碎裂的角度来保护高尔基体，减少缺血神经细胞的凋亡，从而发挥神经保护作用。因此，为了阻止高尔基体的碎裂，我们过表达了高尔基体重组和堆叠蛋白Grasp65，它被证实能在细胞有丝分裂时特异的抑制高尔基体的碎裂[4,14]。转染Grasp65后HT22细胞在氧糖剥夺再灌注所致高尔基体碎裂出现减少，碎裂程度减轻，同时GM130、GAAP的表达显著增加，最后致使HT22细胞的存活率大大提高，凋亡率显著降低。提示过表达Grasp65减轻缺血再灌注损伤所致的高尔基体碎裂，可以减少缺血神经细胞的凋亡，改善神经功能，其机制可能与上调GM130、GAAP的表达有关。

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Morphological alterations of Golgi apparatus after oxygen-glucose deprivation followed by reperfusion and intervening by over-expressed Grasp65 in HT22 cells and their underlying mechanism

WANGJia,XIONGJu,ZHOUWensheng.

(DepartmentofNeurvousDisease,HunanInstituteofGerontology,HunanProvincialPeople’sHospital,Changsha410016,China)

Objecive To investigate Morphological alterations of Golgi apparatus after oxygen-glucose deprivation followed by reperfusion (OGD/R) and intervening by over-expressed Grasp65 in HT22 cells and their underlying mechanism.Methods Using mouse hippocampal neuronal cell line HT22 as the research object.After OGD/R and intervening by over-expressed Grasp65,using MTT method to detect cell viability and hoechest33258 fluorescence staining method to evaluate cell apoptosis.Morphology of Golgi apparatus were observed with cytochemistry immunofluorescence.The protein expressions of GM130 and GAAP were detected by Western blot.Results HT22 cells activity was significantly decreased (P<0.05) via OGD/R induction and apoptosis rate increased significantly (P<0.05).OGD/R could also lead to abnormal Golgi morphology.Along with the reperfusion time extended,the Golgi apparatus gradually fragmented,it was the most obvious at 12 h and 24 h of reperfusion.The protein expression levels of GM130 and GAAP were decreased significantly at 12 h and 24 h time points after OGD/R (P<0.05).Performing OGD/R treatment after over-expressed Grasp65 in HT22 cells,Golgi fragmentation were significantly decreased (P<0.05) and the degree of fragmentation alleviated.The protein expressions of GM130 and GAAP were significantly increased (P<0.05).HT22 cells survival rate was greatly improved (P<0.05) and apoptosis rate decreased significantly (P<0.05).Conclusions In the cell model of ischemia reperfusion injury,the same happened to fragmentation of the Golgi apparatus.Over-expression of Grasp65 could alleviate OGD/R-induced Golgi fragmentation and reduce HT22 cells apoptosis,possibly related to the up-regulation of the expression of GM130 and GAAP.

Golgi fragmentation; Apoptosis; Mouse hippocampal neuronal cell line HT22; Grasp65; GM130

1003-2754(2016)12-1067-05

2016-08-24；

2016-09-30 基金项目：湖南省自然科学基金(No.14JJ2143)；湖南省卫计委科研项目(No.B2012-121) 作者单位：(1.湖南省人民医院湖南省老年医学研究所神经疾病研究室，湖南 长沙 410016；2.湖南省人民医院马王堆院区神经内科，湖南 长沙 410016) 通讯作者：周文胜，E-mail：zhouwensheng2004@163.com

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