COL4A1/A2基因变异与出血性脑血管病及梗死后出血转化研究进展

索阅，李伟，王拥军

出血性脑血管病是脑血管病中致残率、致死率高的类型，血脑屏障破坏参与了脑出血的发病、血肿扩大、颅内压增高等病理过程。基底膜成分的异常间接提示着血脑屏障的破坏。4型胶原作为基底膜的重要组成部分，是许多出血性脑血管病动物实验中血脑屏障破坏的观测指标之一。COL4A1/A2基因的变异可导致穿通脑、COL4A1/A2相关性脑血管病或遗传性血管病、肾病、动脉瘤和肌肉痉挛综合征，并且与散发性深部脑出血、反复脑出血存在相关性。研究COL4A1/A2基因变异与脑出血、蛛网膜下腔出血、梗死后出血转化为代表的散发性出血性脑血管病的相关性，将有助于出血性脑血管病针对性治疗和发病后的出血控制。

1 出血性脑血管病及其危害

出血性脑血管病主要包括脑出血、蛛网膜下腔出血及梗死后出血转化。患病人群预后较差，给社会带来较大负担。2013年一项中国卒中类型的流行病学分析研究发现中国人群与白种人人群（6%～20%）相比，总体上脑出血占所有类型脑血管病的比例更高（17%～51%）[1]。全球疾病负担（Global Burden of Disease，GBD）研究估计2010年全球新发出血性卒中事件的发病率为81.52/100 000（95%CI72.27～92.82）[2]。脑出血的幸存者仍有复发风险，尤其对于潜在病因不明的患者。一项纳入多项观察性研究的系统评价发现复发性脑出血的年风险率为2.0%～2.4%，第一年的复发风险高达1.8%～7.4%[3]。

在世界卫生组织的研究中，中国动脉瘤性蛛网膜下腔出血发病率为2.0/100 000[4]。而且1/4动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者死亡，约一半的幸存者遗留一些永久性神经功能缺损。

出血转化可发生在10%～40%的缺血性卒中患者中，增加卒中的致残率及致死率。

2 COL4基因变异

单核苷酸多态性变异、可变数串联重复序列、转座子的有/无以及结构变异在基因组中分布密度较大，被认为是导致个体间表型差异、各种遗传性疾病及疾病易感性的重要原因[5]。研究一些已知单基因遗传的脑血管病对发现散发脑血管病致病机制有一定启示作用。临床研究的分子层面上，人群中某一染色体位点或基因的常见、少见或罕见变异与表型的研究有助于发现散发性脑血管病发病机制。多项病例报道及基础、临床研究发现COL4基因与出血性脑血管病关系密切。

2.1 基因变异的分类与定义 人类基因组中常见的遗传变异类型主要有单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）变异和拷贝数变异（copy number variant，CNV）。SNP是指染色体基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括碱基的转换、颠换、插入或缺失[5]。

SNP由于其二态性、分布广泛而成为研究个体间表型差异、不同群体和个体对疾病易感性的研究热点。基于常见疾病/常见变异模型（common disease/common variant，CDCV）和经典疾病异质性假说中间的中立假说，最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）＞0.01的SNP可能导致＞90%的个体间基因异质，继而很大程度上导致表型的异质[6]。常见变异是指MAF介于0.05～0.5之间的基因变异，少见变异是指MAF介于0.01～0.05之间的变异，罕见变异是指MAF＜0.01的变异。

2.2 胶原4基因及产物 4型胶原占基底膜（basement membrane，BM）成分的50%左右[7-8]。在哺乳动物中，胶原4蛋白是由6种不同且相互关联的胶原4a蛋白基因——COL4A1到COL4A6分别编码的。其中a1（Ⅳ）蛋白和a2（Ⅳ）蛋白是典型胶原4分子的a蛋白，具有物种间高度保守性。其蛋白产物几乎出现于所有基底膜组织中[9]。人类的COL4A1和COL4A2基因位于第13号染色体。包括增强子在内的额外调节元件位于COL4A1和COL4A2的第一个内含子区域，在双向启动子启动的转录过程中必不可少[10-12]，并有报道COL4A2下游存在静息子[12]。顺式调节元件之间的相互作用调节人类COL4A1和COL4A2基因的转录，保证组织特异性和表达产物蛋白分泌的水平与比例[13-14]。COL4A1和COL4A2以5’端相邻，之间间隔127 bp的片段，为共用的双向、结构特殊的启动子区。编码的前胶原蛋白多肽链包含成胶原结构域，以甘氨酸-X-Y的形式重复排列，即每3个氨基酸即有一个甘氨酸出现。A1和A2链以A1A1A2的方式构成异源三聚体，并通过链间结构域的相互作用最终交联称为超分子4型胶原网络结构。4型胶原对BM的构成、介导BM与细胞间的相互作用、维持其稳定性起到重要作用。

2.3 胶原4基因变异相关单基因遗传脑血管COL4A1/A2相关的小动脉病是一类可婴儿期或成年期起病的具有神经系统、全身系统性表现的疾病，与COL4A1突变相关的常染色体显性遗传疾病被归结为四类：常染色体显性遗传1型穿通脑，脑小血管病伴脑出血[15-16]，脑小血管病伴Axenfeld-Rieger畸形伴遗传性血管病肾病，遗传性血管病、肾病、动脉瘤和肌肉痉挛综合征（Hereditary angiopathy with nephropathy，aneurysm and cramps，HANAC）。同一染色体位点上COL4A2基因突变可导致相似的包含脑血管病的多系统受累表型：反复颅内出血[17]、早发孔洞脑畸形、先天性偏瘫、颅内动脉瘤、肾病、肌病。

2.4 胶原4基因与散发性出血性脑血管病 散发性出血性脑血管病的发病年龄相对较大、致死率高的特点使得家系分析较为困难，密集的基因组水平基因分型工具的发展可以分析同一祖先的非亲缘关系人群中的个体基因信息，并可分析不同表型致病基因的遗传性估计值[18-20]。随着分子遗传学进展及在医学基础研究中的应用，尤其全基因组关联分析（genome wide association study，GWAS）技术的应用，使得查找出血性脑血管病致病或相关基因位点成为可能。

3 胶原4基因与脑出血

3.1 人群基因研究 2007年Vahedi等[21]报道了一例COL4A1基因（G805R）突变导致反复深部脑出血；2012年一项COL4A2编码区及侧翼序列测序研究，在入组的96例患者中，4例脑出血患者中发现3个导致物种间高度保守的氨基酸缺失的SNP：COL4A2E1123G，COL4A2Q1150K，COL4A2A1690T，这3个SNP未出现在正常对照组的284例个体中，其中的2个SNP可导致COL4A2蛋白滞留于内质网，从而触发内质网应激并活化未折叠蛋白质反应[22]。另一项COL4A1编码区及侧翼序列测序研究，在入组的96例脑出血患者中（48例可能的淀粉样血管变性、48例可能的高血压性脑出血）有两例携带COL4A1的SNP（rs200786329、rs397514624），在体外细胞功能试验中证实此2个SNP可分别导致脯氨酸羟化异常、前胶原蛋白a1稳定性下降，继而使COL4a1分泌量下降，异常a1蛋白胞内聚集。

围产期新生儿出血性脑血管病可以导致孔洞脑畸形，2013年Murray团队在一位穿通脑患者基因中发现COL4A2基因第28个外显子中一碱基的变异，导致成胶原结构域的其中一个甘氨酸转变为天冬氨酸，并且患者未患病的父亲也具有这一变异。通过对患者家系成员的皮肤活检，证实这一变异可激活未折叠蛋白反应，导致异常折叠的4型胶原在胞内内质网的聚集，促进蛋白酶体对未折叠4型胶原的降解，导致基底膜缺陷。苯基丁酸（phenylbutyric acid，PBA）作为化学分子伴侣可促进蛋白折叠，在患者的成纤维细胞中，使内质网体积减小，降低内质网应激，降低了患者细胞凋亡比例。因此提出分子伴侣可作为出血性脑血管病、孔洞脑畸形的一种干预措施[23]。

一项脑小血管病先证者的家系研究发现，先证者家族中一脑小血管病患者口服抗凝药后因症状性颅内出血去世，此家系患病的6个成员中均发现COL4A1基因的第25个外显子中G1769A变异，导致转录产物由甘氨酸转换为谷氨酸，导致胶原4a1蛋白结构的不稳定，使基底膜不稳定，故考虑具有COL4A1基因变异者对抗凝治疗或具有更高的颅内出血风险[24]。

考虑到一些罕见家族遗传性单基因病的致病基因可能包含与散发性常见形式脑血管病相关的变异，一项纳入15个脑血管病队列研究的欧洲祖先人群系统评价研究中，包含3个队列组成1545例脑出血患者（分为深部或脑叶出血），其分析结果也验证了这一假设，发现胶原4合成基因COL4A1/COL4A2的3个SNP与散发性深部脑出血相关：rs9521732、rs9521733、rs9515199[25]。这3个位于COL4A2内含子区域的常见变异（MAF介于0.05～0.5）与深部脑出血这一表型显著相关，且相互之间具有高度连锁不平衡性，数据分析显示此3个SNP与其他脑血管病表型无显著相关，与已知的COL4A2外显子区的脑出血相关SNP（rs117412802、rs62621875、A1690T）之间无紧密连锁不平衡。

3.2 动物实验研究 上述提到的2006年一项对脑小血管病家族的测序研究后续进行的动物实验发现COL4A1+/Δex40小鼠均出现脑出血，其中50%出生当日即死亡，此种成年鼠倾向于出现自发多灶性脑出血，在观察到的23个脑出血病灶中22个位于基底节区（深部），1个位于脑叶。故考虑COL4A1+/Δex40小鼠具有发生深部脑出血的倾向[26]。

2012年的96例脑出血患者测序研究的后续动物实验中，对培养的COL4A2+/G646D、COL4A1+/Δex40小鼠胚胎成纤维细胞进行蛋白质印迹，发现COL4a1/COL4a2的分泌量减少，而胞内聚集增多，并且验证了内质网胶原蛋白滞留先于胶原蛋白的胞外／胞内比例的上升[21]，导致细胞毒性反应，得出COL4A1和COL4A2基因突变共同具有导致散发性脑出血的作用的结论。

2015年一项COL4A1变异小鼠实验，再次证实细胞内异常胶原蛋白聚集与脑出血有关，并且在脑出血发生的特定时间窗内，给予4-PBA这一外源性分子伴侣促进蛋白折叠，可以有效减小脑出血的严重程度，改善预后[26]。并提出具有胶原4基因变异者在体育运动强度、缺血性脑血管事件后抗栓药物选择方面，应更谨慎地权衡抗栓与出血风险之间的利弊关系。

4 胶原4基因与蛛网膜下腔出血

一项以雄性远交蛛网膜下腔出血大鼠为模型的实验发现，在内膜穿刺手术法制备蛛网膜下腔出血实验组后，利用蛋白电泳及图像分析定量，分析蛛网膜下腔出血后不同时间点出血同侧皮层COL4、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的分布、含量，发现与假手术对照组相比，实验组在蛛网膜下腔出血后24～72 h内，随着基底膜逐渐破坏，血脑屏障通透性增大，造成颅内压升高和血管神经源性水肿，导致功能预后的下降及死亡等终点事件[27]。

两项荷兰人群研究发现4型胶原基因（COL4A1）的变异与颅内动脉瘤相关[28-31]。而在日本人群中，上述研究中COL4A1的相关变异与颅内动脉瘤未见到相关性[31]。

颅内动脉瘤标本病理研究可观察到基底膜成分的碎片，例如4型胶原和纤连蛋白[32]，有观点认为可能由硫酸乙酰肝素糖蛋白-2与其他成分失去关联所致。另一方面，4型胶原碎片的出现也可能由COL4A1变异导致，并且这种变异导致了动脉瘤的破裂[28]。

5 胶原4基因与出血转化

缺血性脑血管病是因血管病变导致神经元死亡的过程，近年来，缺血性卒中脑损害过程中的血管损害受到关注。脑微循环系统的小血管均包含3层结构：血管内皮细胞、基膜、星形细胞末足。内皮细胞和星形细胞末足连接基底膜。发生缺血性脑血管病时，基膜的破坏、拆解使内皮细胞和星形细胞末足与基底膜失去连接，最终导致小血管通透性增加，出血转化，脑组织水肿和微循环功能障碍[33]。

在一项纳入28项观察性研究和19项随机对照试验的缺血性卒中出血转化研究中，发现随着抗血小板及溶栓药物使用的增加，出血转化的发生率明显上升。而在未使用抗血小板药或溶栓治疗的患者中，几乎不会发生严重的出血转化，发生率仅为8.5%，症状性颅内出血发生率仅1.5%[34]。

一系列动物实验和临床研究发现，组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）除溶栓作用外，也是神经血管单元的重要信号因子和细胞外蛋白酶。tPA介导脑发育过程中细胞基质的重塑，干预其可塑性，可通过与NMDA型谷氨酸受体相互作用而增大潜在的细胞毒性钙超载。在特定浓度下，tPA可以定向作用于血管，最终通过增加卒中后MMP的调节异常而破坏细胞外基质的完整性，增加血管源性细胞死亡，血脑屏障渗漏、水肿、出血转化[35]。

4型胶原作为血脑屏障中基底膜的重要成分，在各项实验的免疫标记中被作为基底膜破坏程度、血脑屏障渗漏程度的指标。具有COL4基因变异的患者是否对抗血小板、溶栓治疗具有更高不稳定性，更倾向于出血转化；在缺血性脑血管病后一系列局部脑组织病理变化通路中，基底膜完整性是否较无变异者更易于受到药物、信号因子等继发因素影响，有待进一步探究。

6 总结

基底膜是血脑屏障的重要组成部分，对细胞起结构支持和动态调节细胞行为与微环境关系的作用。4型胶原是基底膜最为重要的组成部分。COL4A1/A2基因的变异已证实与包括反复脑出血、深部脑出血表型的单基因遗传综合征相关。动物实验证实不同的COL4A1/A2基因变异可导致异常折叠的COL4a1、a2蛋白沉积于胞内，导致基底膜稳定性及调节功能降低，可以导致脑出血、梗死后出血转化、脑出血血肿扩大和脑水肿等，引起预后不良及死亡率增加。人群基因研究发现在散发性出血性脑血管病患者可存在COL4A1/A2基因变异。不同遗传背景人群的基因频率、外显率存在差异，进一步开展在不同遗传背景下散发性出血性脑血管病的人群中COL4A1/A2变异筛查，对于理解出血性脑血管病发病机制，早期干预高危人群（例如增加胶原蛋白折叠的外源分子伴侣），寻找新的更具针对性的治疗方法有重要意义。同时，缺血性脑血管病人群中服用抗血小板聚集药物，抗凝药物等抗栓治疗，或是接受溶栓治疗患者，均存在潜在出血风险，对于既往不明原因脑出血、颅内动脉瘤、一级亲属中脑出血病史者，进行高危基因，如COL4A1/A2基因变异的筛查，对于指导二级预防和急性期治疗可能有一定参考意义。

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