耳蜗力学：基底膜行波测量技术进展*

张天宇 王舒琪 任柳杰 李辰龙 姚文娟

耳蜗是听觉系统实现感音换能的核心器官，可对声音信息进行频率分离、主动放大等预处理，兼具宽频率和强度范围声音感知、高灵敏低耗能的优点。耳蜗精巧的结构、特殊的组织材料特性是其功能实现的基础。基底膜的行波现象是耳蜗进行实时频率分离的载体；外毛细胞电致运动则主动放大行波响应，是提高耳蜗敏感性的关键。自1961年Békésy提出行波理论，开创实验听力学以来，大量学者致力于研究基底膜振动特征、外毛细胞听觉放大等问题，以揭示耳蜗高灵敏、宽频率感音机制，形成了耳蜗力学这一多学科交叉研究的热点领域。行波现象的实验测量是耳蜗力学的关键研究手段，测量技术的革新促成了耳蜗感音机制研究的若干次重大突破。

行波测量(基底膜及Corti器振动测量)是耳蜗感音机制研究的最直接方法，分为振动模式(pattern)测量法和点测量法两类。振动模式测量法需要大范围打开耳蜗，以观察耳蜗基底膜区域的振动形态。Békésy即采用该方法并首次发现行波现象[1]，但由于振动模式测量法需要破坏耳蜗正常结构，同时Békésy采用离体标本作为实验对象，因而他测得的基底膜振动呈线性，其调谐响应弱于听神经，据此Békésy认为蜗后(如神经)存在进一步的频率锐化，即所谓“第二滤波器”。点测量法仅测量基底膜上某一点的振动，耳蜗损伤较小，是目前耳蜗力学研究的主流方法。二十世纪七十年代发展的莫斯鲍尔技术(Mössbauer technique)是第一个应用于基底膜测量的高精度、高灵敏度的技术手段。利用该技术Rhode发现基底膜振动具有压缩非线性，该发现启示并引领了耳蜗主动机制研究。上世纪八十至九十年代，激光多普勒测振仪(laser doppler vibrometer，LDV)以其非接触式测量、高精度和高空间分辨率的优点，加之商业化LDV的广泛应用，成为中、内耳力学研究的最重要测量技术之一。但是，应用LDV进行行波测量需要在耳蜗骨壁钻孔以暴露基底膜，仍会影响耳蜗正常生理活动，干扰实验结果。尽管LDV可实现耳蜗蜗底高频区基底膜振动测量，但对于蜗顶低频区的测量存在困难。近年来体积相干光断层扫描测振技术(volumetric optical coherence tomography vibrometry，VOCTV，也称相敏OCT，phase-sensitive OCT)以其高空间分辨率、穿透式测量的优点，可部分弥补上述技术的不足，尤其是在耳蜗低频区测振、Corti器微观结构振动测量方面取得突破性进展[2～4]。

本文阐述自Békésy以来，耳蜗力学领域行波测量技术的沿革、各自优缺点及主要研究成果。这些技术和成果推动了行波理论的不断完善，即对耳蜗感音力学机制的深入理解。如何开发和应用新技术进一步揭示耳蜗高效感音的机制，这些新技术及成果又如何应用于临床实践，是未来耳蜗力学研究的两大主题。

1 莫斯鲍尔技术

莫斯鲍尔技术应用原子核辐射的γ射线无反冲共振吸收的莫斯鲍尔效应。原子核共振过程受能量调节，震源运动能引起可检测的多普勒频移。利用该效应可实现高精度的振动测量。

Rhode(1971)成功利用莫斯鲍尔测振技术在活体松鼠猴耳蜗中观察到基底膜振动具有压缩非线性特性。Sellick(1982)及Le Page(1980)等在此基础上，进一步发现基底膜具有尖锐的调谐反应，该反应与听神经反应一致，与Békésy测量结果不同。综合Kemp(1978)发现的耳声发射现象，否定了第二滤波器假说，证明“耳蜗主动机制”的存在，是耳蜗力学研究的又一里程碑式突破。

然而莫斯鲍尔技术具有一定的局限性，如：①测量需在基底膜上放置放射源，改变基底膜质量，造成基底膜损伤，导致测试时间窗较窄，影响测试结果; ②γ射线具有极强的非线性，在测量过程中会对基底膜振动的谐波成分造成数据干扰; ③测量时需要使用放射物质，难以推广应用。随后莫斯鲍尔技术被基于干涉原理的激光多普勒测振技术取代。

2 激光多普勒测振技术

激光多普勒测振(LDV)技术应用了光学多普勒效应和光束干涉原理。由于激光具有良好的线性特性及对微小速度变化的高度敏感性，LDV成为耳力学研究的又一理想技术，其测量精度可达到纳米级。由于中、内耳结构微小、复杂，在振动测量研究中，LDV常需与声激励系统、隔振台及解剖显微镜耦合使用。

Tonndorf和Khanna(1968)利用LDV技术首次实现鼓膜振动的测量。但受激光质量、光学元件的制造工艺和信号处理等因素的影响，早期LDV无法进行耳蜗基底膜振动的精确测量。1982年Khanna对激光光源进行改进，设计了激光零差测振系统，首次实现LDV基底膜振动的测量。

大部分基于LDV的行波振动测量部位多局限于基底膜高频区。总体而言，不同物种耳蜗高频区基底膜响应规律相似，即压缩非线性特征在最佳频率处显著，其余位置呈线性，再一次证明基底膜响应具有极精细的频率选择性。利用LDV对蜗顶低频区基底膜振动测量较为困难，有限的研究结果提示低频区基底膜压缩非线性特性可能不如高频区敏锐。但进行低频区基底膜振动测量时需要对前庭膜开孔，导致内外淋巴液混合，破坏耳蜗正常生理环境，对毛细胞功能造成影响。而Khanna(1989)通过研究外毛细胞受损时基底膜调谐变化，证明正常活性的外毛细胞是耳蜗实现频率分离的基础，因此低频区耳蜗响应的LDV测量结果不足以反映正常生理状态下的基底膜调谐规律。

除对基底膜响应的压缩非线性特征进一步探究外，利用LDV还可对蜗隔各部分的振动形式分别进行测量。由于Corti器坐落于基底膜上，在耳蜗力学研究中两者密不可分，有时将它们视为整体，统称为蜗隔(cochlear partition)。蜗隔的振动极为复杂，以径向为主，在Corti器附近振动方向垂直网状板。Hensen细胞区振幅最大，但相位稍滞后于外毛细胞区。Greenwood(1996)对不同物种耳蜗各回基底膜振动进行测量，通过对比低、中、高频区基底膜振动特点，总结基底膜长度和特征频率对数的线性关系，对两栖类、哺乳类动物拥有超宽听觉动态范围(强度/频率)的机制进行探究，通过分析哺乳类动物听觉演化过程中耳蜗声音频率分析功能逐渐加强的原因，更进一步的明确了频率辨别的部位机制及毛细胞在其中所起的重要作用。

由于LDV为10～20 dB SPL声刺激下基底膜响应的测量提供可能，关于耳蜗主动机制的研究取得新的突破性认识，即证伪“逆向行波学说”。既往学者多认为耳声发射现象源于基底膜的逆向行波，2004年Ren(任田英)对于耳声发射现象进行实验测量，实验中仅观测到基底膜的顺向行波，据此否定了逆向行波假说；尽管目前学界对此结果仍存有争议，由于Ren在研究中观察到镫骨提前振动的现象，据此Ren提出耳声发射的主要途径是耳蜗液体中的压力波。此外，有学者对LDV进行技术改良，如Cooper(1999)改进了反射光与入射光分离的技术；Jacob(2009)将LDV与激光扫描共聚焦显微镜的耦合，为耳蜗微机械力学的研究提供更好的稳定性和可操作性。

同样，LDV技术也存在某些不足，如测量时必须在耳蜗骨壁上开孔(约0.2 mm)以暴露待测基底膜，因此需要使用玻璃片封闭窗口等方法减少内外淋巴液的流失，即便如此耳蜗开孔仍会造成内外淋巴液混合和毛细胞损伤[5]，影响测量结果，限制了内耳病理状态下基底膜振动的研究。

3 体积相干光断层扫描技术

体积相干光断层扫描测振技术(VOCTV)是OCT的改进。OCT应用宽带光的干涉现象进行成像，通过测量光束发射至反射的延搁时间来定位光的反射深度，使不同深度组织结构在图像上进行映射和解析(Ren,2001)。临床上OCT已广泛用于多种器官如眼球、冠状动脉、支气管、食管和皮肤的无创及微创诊断成像[6,7]。因OCT可清晰地对耳蜗各亚显微结构如盖膜、前庭膜及Corti器进行成像和观测[2,3,8]，满足对耳蜗基底膜各结构振动的空间特征和行波的进一步研究需要，参考LDV测振原理，经改良探测光束、数据采集设计及运算方法，制成具有多普勒测振功能的VOCTV，可对耳蜗基底膜的振动进行穿透式、非接触的无创测量。

Choudhury于2006年首次成功利用VOCTV对开放的豚鼠耳蜗基底膜振动进行测量。同年Hong(2006)及其团队亦报道利用VOCTV实现离体耳蜗基底膜、盖膜、前庭膜及外毛细胞的振动测量。早期的VOCTV测振研究受信噪比及穿透深度限制，实验对象以离体耳蜗为主，后经仪器改进，在体耳蜗基底膜振动的测量研究逐渐开展。VOCTV技术使在保持耳蜗完整状态下对基底膜振动的测量成为可能，消除了此前耳蜗开窗术对基底膜功能和状态的影响，成为耳蜗力学研究技术的一个重要突破[5]。利用VOCTV对耳蜗低频区基底膜振动测量的研究结果提示啮齿类动物耳蜗低频区压缩非线性程度较低，具有低通特性，频率选择性不如高频区敏锐[9～12]。此外，VOCTV的分辨率满足了对耳蜗各亚显微结构相对运动观测的需要，实现了对各结构间声波传递规律的探索，如盖膜行波现象的观测、盖膜与前庭膜间的相对运动[3,8]、网状板和基底膜间的相对运动，揭示Corti器的滤波原理和耳蜗主动机制[8,13,14]，进一步证实外毛细胞在其中所起的重要作用[15]。为探究各结构三维空间上的运动特性，Lee等团队利用基因敲除技术制造前庭膜、盖膜及外毛细胞纤毛连接松解的模型小鼠，实现了对Corti器及前庭膜轴向运动的测量[3]。

由于VOCTV测量保持耳蜗的完整性，使内耳病理状态下基底膜振动测量成为可能，对于内耳病理状况的评估具有重要的应用前景。Xia(2018)通过基因敲除技术制造第三列外毛细胞缺失小鼠，对该病理状态下Corti器振动方式进行探究，证实了VOCTV技术在耳蜗病理机制探究中的重大潜力。

VOCTV技术的主要不足是穿透深度有限，这限制了VOCTV在耳蜗力学振动测量领域的进一步应用。VOCTV的成像空间分辨率和穿透深度相互制约，如横向分辨率为10 μm时(小鼠Corti器高度约100 μm)，最新的VOCTV穿透深度仅为1.5 mm(表1归纳了目前研究中常用的VOCTV仪器型号、穿透深度及分辨率)。因此，VOCTV在体基底膜测振的实验对象多为耳蜗骨质较薄的啮齿类动物[3,4,8～11]，且需耦合使用如转角镜等一些辅助机械[16]。目前，VOCTV技术仍在不断改进发展中，其分辨率和穿透深度都有望进一步提高。

表1 研究中常用的VOCTV仪器基本参数

4 展望

自Békésy提出行波理论获得诺贝尔医学与生理学奖(1961年)以来，随高精度测量技术的发展，研究者对耳蜗的机械特性及主动增益有了进一步的认识，LDV与VOCTV在内耳力学振动测量领域中的应用更成功地对生理状态下耳蜗感音机制进行深入解析，有望在未来实现病理状态下耳蜗响应的研究，协助临床明确内耳疾病的病理机制，启发新的诊断技术研发。未来仍然需要对基底膜行波现象的高精度和高空间分辨率测量、对Corti器亚显微结构的相互作用与影响等进行分析。①Corti器的三维振动测量。Corti器的复杂三维运动的测量有助于对比分析Corti器各部分振动响应差异，探究毛细胞在耳蜗频率辨别中所起的作用。进行Corti器三维运动的观测需对基底膜各部分结构进行较清晰的成像，以便在图像中进行辨认，因此对VOCTV的分辨率要求较高。现有的VOCTV不能满足测量需要，需对测量仪器进行改进与完善，目前，对Corti器的三维运动观测尚处于起步阶段[19]。②纤毛-盖膜两者间的相对运动。盖膜下液体的流动时可形成剪切力，刺激外毛细胞纤毛，引起耳蜗内力-电信号的转换。外毛细胞电致运动是耳蜗主动机制的关键。但对于三排外毛细胞所司功能差异、声刺激引起外毛细胞活化的具体机制及盖膜在耳蜗主动放大功能中所起到的作用尚待进一步探讨[20～23]，以建立内耳疾病中外毛细胞纤毛的损伤情况和听力损失程度二者间的联系，对听力损失进行详细分类，使患者可以接受更有针对性的治疗，恢复或保留残存听力，改善疾病预后。但目前尚无可以进行上述研究的有效手段，有赖于未来新型测量仪器的开发。