选育纤维素乙醇生产的高效产酶工程菌技术的研究进展

闫玉玲， 姚秀清， 张 全， 曹长海

（1. 辽宁石油化工大学，辽宁 抚顺 113001；2. 中国石油化工股份有限公司 抚顺石油化工研究院，辽宁 抚顺 113001）

选育纤维素乙醇生产的高效产酶工程菌技术的研究进展

闫玉玲1， 姚秀清1， 张 全2， 曹长海2

（1. 辽宁石油化工大学，辽宁 抚顺 113001；2. 中国石油化工股份有限公司 抚顺石油化工研究院，辽宁 抚顺 113001）

综述了近年来选育高效产纤维素酶工程菌取得的最新理论研究及工艺进展，并就复合理化诱变获取高效产酶菌，以及利用原生质体融合、原生质体诱变、基因工程等技术对各种产纤维素酶、半纤维素酶菌株进行遗传改造，对纤维素酶高效产酶工程菌的选育进展进行了总结，进一步展望了选育高产纤维素酶菌株的研究方向。

木质纤维素；纤维素酶；菌株；原生质体；诱变；融合；基因工程

木质纤维素主要包括纤维素、半纤维素和木质素，是一种丰富且廉价的可再生资源。据估计，全球每年绿色植物体通过光合作用产生的干物质高达1.55×1011吨，其中纤维素和半纤维素约占55%[1]。随着石油、煤等能源的短缺及各种环境问题的出现，木质纤维素类生物质资源由于其可再生性及环境友好性等特点受到世界各国研究者的广泛青睐，成为科学研究热点[2]。在美国，生物质能源的利用提到了战略高度，美国能源部提出，到2030年，全美5%的电力、20%的运输燃料以及25%的化学产品均由生物质能源提供[3]。我国也是生物质资源最丰富的国家之一，中国至2050年生物质资源科技发展路线图也提出“大力发展大规模商业化生物质能源，至2050年中国要实现生物质资源代替30%左右的进口石油，逐步实现由生物质资源大国向生物质资源强国转变[4]”。

通过生物化学技术将木质纤维素转化为生物乙醇及丁醇等生物燃料的生产过程在国外已经取得良好的成果，然而国内影响和制约纤维素乙醇产业化发展的关键技术还远未解决，其发展进程还处于产业化发展的初级阶段。降低纤维素酶的生产成本是实现纤维素乙醇规模化生产的关键。其中，降低纤维素乙醇生产的成本通过以下三种途径来实现：一是通过筛选纤维素酶优良生产菌株来实现；二是通过优化产酶发酵工艺，如同步产酶与酶解及酶的复配工艺等技术来实现；三是通过优化纤维素酶的生产条件提高纤维素酶的产量和活性。本文在综述了纤维素乙醇生产酶高活力菌株选育技术的基础上，就近年来国内外提高纤维素酶菌株活力取得的最新理论研究及工艺进展进行了相关的评述。

1 与纤维素酶有关的微生物

自然界为纤维素酶的来源提供了广阔的途径。纤维素酶分步广泛，在细菌、真菌、放线菌中都有大量的分布，这三类产纤维素酶微生物性能比较见表1。已经发现真菌中具有降解纤维素能力的微生物有近200种，其中，丝状真菌是研究最多的纤维素降解类群[5]。真菌纤维素酶产量高，可达20 g/L以上。真菌主要产生分泌型纤维素酶，且所产真菌纤维素酶呈酸性，对木质纤维素的降解程度高，在纤维素乙醇生产过程中扮演着重要角色。里氏木霉、绿色木霉、黑曲霉等真菌都是最具有代表性的纤维素酶生产菌种。细菌主要分泌中性或碱性的纤维素酶，且大多为内切葡聚糖酶，属于胞内酶，很少能分泌到细胞外，酶的产量也不高。细菌纤维素酶作用时吸附于细胞壁上，从纤维的表面由外向内生长完成降解，降解后的纤维表面呈锯齿蚀痕。细菌分泌的纤维素酶的提取和纯化难度较大，且大多数细菌所产纤维素酶对结晶纤维素没有活性，因此在工业生产中应用的不多。放线菌能容易地降解半纤维素，但是对纤维素几乎没有降解能力。放线菌的纤维素酶的分泌型较少且产量极低，对天然纤维素的水解作用较弱，因此放线菌很少作为纤维素酶的生产菌。

表1 三类产纤维素酶微生物性能比较

2 高活力产纤维素酶菌株的选育技术

从自然界中分离纯化的野生菌株产纤维素酶的活力较低，酶系不完整，无法直接投入生产。因此，利用各种手段和技术对产纤维素酶菌株进行改造以提高酶产量或改变其酶学性能，是降低纤维素酶生产成本的重要方法。

2.1 理化诱变技术

2.1.1理化诱变分类

1）常规理化诱变 是通过物理、化学或者生物诱变剂处理微生物孢子或细胞实现遗传突变，从而获得纤维素酶高产突变菌株[6]。

2）复合理化诱变 在实际生产中菌株经过单因子诱变剂的长期诱变之后易产生“疲劳效应”（如菌种生长周期长、孢子量减少、代谢减慢等现象），采用多种诱变剂复合或者交叉处理的方法进行菌株诱变可获得菌落生长速率快、产酶能力高的突变菌株。研究发现，复合诱变具有协同效应，在多次传代试验中，菌株的性状也比较稳定，说明复合理化诱变比单因子诱变效果要好。

2.1.2理化诱变方法

常用的诱变方法主要3种：1）物理方法。主要采用物理诱变剂如紫外线、X-射线、超声波、微波等使菌种发生随机突变。2）化学方法。应用化学诱变剂，如亚硝基化合物、烷化剂、氯化锂、叠氮化物、抗生素、硫酸二乙酯等。3）生物诱变法。指通过生物手段对纤维素酶的基因和生成途径进行调控和干预。在纤维素酶真菌的诱变过程中，通过这三种手段单用或联合使用，大幅度地提高了酶的活力和产量，诱变效果良好。在实际育种工作中，采用多种育种手段联合方法是获得优良菌株的重要手段。因此，复合理化诱变处理微生物细胞或孢子是选育高产菌株的更有效方法，现在使用的许多高酶活菌株多是通过该方法获得的。

2.1.3理化诱变筛选抗阻遏突变菌株

纤维素酶生产中酶产量低的主要原因是酶合成中产生了大量阻遏抑制酶生成的代谢终产物葡萄糖。这一现象称为降解物阻遏抑制现象。纤维素酶的合成受双重因子调节，即诱导物诱导和分解产物阻遏。通常通过筛选诱导物来提高纤维素酶活性很难实现，而在自然界中又很少存在能够进入细胞并具有较强诱导能力的可溶性物，因此研究者大多都是通过筛选抗阻遏突变株的方法来获得高产菌。

例如，方芳等[7]以紫外和微波两种方法复合诱变来自中国工业微生物菌种保藏管理中心的原始菌株Trichoderma asperelloides41245，选育出了具有高纤维素酶活的Trichoderma asperelloides菌株。曲音波[8]改进了抗阻遏突变株的筛选方法，用纤维素代谢终产物葡萄糖代替甘油，用脱木素木粉代替磷酸膨胀纤维素，制成双层平皿，直接根据突变产生透明圈能力变化，从紫外线和亚硝基胍（NTG）复合诱变后的变异株中，筛选出了2株具有抗阻遏高产菌株——斜卧青霉JU15和Jul。这些突变株不仅可以在含有可溶性糖的培养基上合成纤维素酶，而且其在产酶培养基中的产酶能力也得到较大幅度的提高。

国外学者对产酶菌所做的理化诱变有：Bandyopadhyay等[9]采用甲基硝基亚硝基胍对野生型米根霉菌株进行诱变，从50株透明圈增加的突变株中筛选到一株内切葡聚糖酶活性增加的菌株，其羧甲基纤维素酶活性增加33%。Dillon等[10]采用紫外线、甲基硝基亚硝基胍、亚硝酸、硫酸二乙酯及溴化乙锭的两两组合分别对特异腐质霉进行两轮诱变，获得具有高纤维素酶活性菌株H. insolensTAS-13UV-4NG-5，与野生型菌株相比，其羧甲基纤维素酶活性增加115%、滤纸酶活性增加303%、β-葡萄糖苷酶活性增加196%。Hungund等[11]对青霉9A02S1菌株经过氧化氢诱变，筛选得到一株更快分泌纤维素酶的突变株。与母株相比，突变体表现出更高的内切葡聚糖酶生产速率，发酵第3天其内切葡聚糖酶活性可达到16.96 U/mL。文献[12]研究表明，紫外线和硫酸二乙酯诱变可提高纤维素生产菌株木葡糖酸醋杆菌NCIM 2526的纤维素酶产量，野生型菌株经上述诱变后，筛选得到一株突变株GHEM4，其纤维素产量提高98%，达到5.96 g/L。

2.1.4抗药性突变株的筛选

有些抗生素如衣霉素、万古霉素、两性霉素等能够增强酶的转录表达水平，同时影响酶的翻译、修饰、分泌等环节，使得胞外酶产量提高。因此，可以通过选育抗药性突变株来筛选胞外酶来实现菌株高产酶量。于春生等[13]结合紫外线和氯化锂进行复合诱变，利用哈茨木霉菌株改良多菌灵，获得了良好的抗性改良效果。赵晓军等[14]采用嘧霉胺药剂处理敏感菌株黄瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea），并测定了其三种胞外酶（羧甲基纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶）的活性。结果表明，药剂处理后，黄瓜灰霉病菌对嘧霉胺产生抗性，敏感菌株的胞外酶活性较处理前均升高，而抗性菌株的胞外酶活性降低。

2.2 原生质体融合技术

原生质体融合（Protoplast Fusion）指用自然或人工方法使2个或更多个不同的细胞融合成1个细胞的过程。该技术可打破物种间细胞不能相互融合的障碍，是获得纤维素酶高产菌株的理想育种途径。研究者对各不同属种的纤维素酶系之间的亲和相容性或多态性进行研究，利用细胞融合技术，可以实现既能分解纤维素，又能分解木质素的双重功效。近年来，随着新技术的发展，如灭活原生质体融合、离子束细胞融合技术等，原生质体融合技术取得了新的进展。对于纤维素酶生产菌株的改良，原生质融合技术比常规诱变育种具有更大的优越性。例如，将里氏木霉和黑曲霉进行原生质体融合，筛选到的融合子一方面充分利用里氏木霉能大量合成外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶的优点，另一方面克服了β-葡萄糖苷酶活力低的缺陷[15]。例如，El-Bondkly等[16]采用聚乙二醇（PEG）法和电融合法将两株哈茨木霉进行种内原生质体融合实验，得到了一系列融合子，结果表明，采用电融合法得到的融合羧甲基纤维素酶活性和β-葡萄糖苷酶活性分别比原始菌株增加41.66%和16.27%。在此基础上，El-Bondkly等[17]又对野生型木霉、青霉和曲霉进行紫外诱变，得到高产纤维素酶的三个突变株，并对其进行原生质体融合，得到的重组菌株在固态发酵条件下羧甲基纤维素酶活性、滤纸酶活性、β-葡萄糖苷酶活性分别达到450、191、225 U/g干物质。Kaur B等[18]将构巢曲霉和塔宾曲霉进行了种间原生质体融合，得到的融合子在摇瓶和固态发酵条件下，内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡聚糖苷酶及滤纸酶活性均有显著提高。进一步的蛋白组学研究表明，该融合子内切木聚糖酶、内切几丁质酶及β-葡聚糖苷酶的表达水平都有明显提高。原生质体融合技术操作简单，是微生物育种的一种有效手段。在选育理想的融合株时可以有目的地选择亲株，无需了解双亲详细的遗传背景，从而不受亲缘关系的影响。但是，目前原生质体融合技术只限在两个菌之间的融合及融合后染色体重组的随机性，限制了其研究发展。

2.3 原生质体诱变技术

去除细胞壁的原生质体对诱变剂更为敏感，通过诱变原生质体来提高产酶量，容易得到优良的突变株。原生质体诱变是经物理或化学诱变剂对育种材料处理后，再进行再生培养，最后从再生菌落中筛选高产突变株的一门技术。

原生质体诱变技术在抗生素、酶制剂、有机酸等高产突变株选育中得到广泛应用。尤其在对丝状真菌的选育中，已取得了许多有应用价值的成果。例如，对丝状真菌中产酶活力较强的菌种如木霉、青霉、曲霉等进行原生质体诱变，较短时间内菌种的变异率大幅度提高，可以成功获得比出发菌株产酶高、性能稳定的突变菌株。近年来，随着新诱变源的出现原生质体诱变技术有了新的进展。例如，离子注入技术使原生质体诱变的应用更加广泛。沈莹等[19]通过对简青霉原生质体进行紫外诱变，提高了出发菌株J的木质素降解酶酶活，诱变菌株J18和J12对木质素降解率分别提高198.1%和67.5%。Xu F等[20]对野生型绿色木霉进行了一系列诱变，首先对木霉原生质体进行紫外诱变、然后采用低能量离子束、等离子体、甲基硝基亚硝基胍等处理方法对上述突变株的孢子进行进一步的诱变，从得到的大量正突变株中筛选到一株纤维素酶活性强的菌株，与野生型菌株相比，其内切葡聚糖酶活性增加1.18倍，β-葡萄糖苷酶活性增加1.27倍。Feng Xu等[21]通过原生质体“递推式融合”方法使正突变菌株进行基因组重组，得到的重组菌株滤纸酶活力比野生型菌株提高1.97倍。

2.4 基因工程技术

运用基因工程在分子水平上对纤维素酶基因进行改造，可以快速、定向地克隆纤维素酶基因，获得新的高比活力纤维素酶。改造后的纤维素酶在稳定性和催化活性等方面有很大的提升，对提高酶的生产效率、降低生产成本具有重要意义。因此，通过基因工程构建高效表达高活性纤维素酶的基因工程菌，是国内外研究的热点之一。人们已经将纤维素酶的基因克隆到细菌、酵母、真菌中，并得到了重组型纤维素酶的高效表达。

2.4.1目的基因的选择

目的基因的获得是实现克隆和表达纤维素酶基因的第一步。对于序列己知的目的基因，从基因组中调取目的基因是最常用的手段之一。对于序列未知的目的基因，则需要通过构建cDNA文库―克隆至载体―宿主培养―确定目的基因等一系列步骤实现。目前纤维素酶基因的克隆己从多种细菌和真菌中实现，同时与之相关的基因文库也得到构建，其中一些纤维素酶的基因已在大肠杆菌[22]或真核微生物[23-25]中得到了表达。随着基因重组技术的快速发展，特别是以分子克隆为基础的克隆技术的发展，纤维素酶基因一级结构的测定越来越多地展开。在Swiss-Prot蛋白质序列数据库（由欧洲分子生物学实验室主持建立的蛋白质序列数据库）中，己有数百个内切酶、外切酶和β-葡萄糖苷酶的全序列。在欧洲分子生物学实验室数据库GenBank、EMBL，以及日本DNA数据库DDBJ等共享数据库中，有7000多个纤维素酶基因序列和500多个纤维素酶的3D结构。

2.4.2表达系统的建立

要得到目的基因的表达产物，必须将其在合适的表达系中表达，再去筛选。目前常用的表达系统有原核表达系统和真核表达系统。原核宿主细胞主要是大肠杆菌，真核细胞包括酵母和丝状真菌等。

1）原核表达系统 大肠杆菌是应用广泛的纤维素酶表达系统，He J等[26]克隆了里氏木霉中内切木聚糖苷酶基因，再在噬菌体强启动子T7上将目的基因重组整合，最后在大肠杆菌BL21中克隆，最终实现了纤维素酶的融合表达。Zhang等[27]在大肠杆菌体内克隆了内切葡聚糖苷酶基因的原始型和突变体，重组后的两种形式的内切酶基因对纤维素的水解效果良好。Kim等[28]克隆了真菌中编码内切葡聚糖酶（EG）的耐热纤维素酶基因Cel8Y，并在大肠杆菌E.coliXL1-Blue中成功表达，重组子最适反应温度达到80℃。虽然大肠杆菌是目前使用较多且成熟的基因工程表达系统，但是用来表达纤维素酶基因存在两个主要问题：一是其产物常为没有活性的包涵体，酶蛋白不能分泌，表达水平低。二是提取难度很大，因而离工业化应用还有一定的距离。

2）真核表达系统和转化 真核表达系统是近年来用于表达外源基因新的表达体系。木霉和曲霉是公认的真核微生物安全生产菌株，在工业生产中作为工程菌得到广泛应用[29]。例如，文献[30]将来自真菌的3种纤维素酶插入里氏木霉中表达后得到的新的纤维素酶混合物，较普通商业酶具有热稳定性和水解液温度高的特点，而同时对纤维素具有很高的降解率，高达理论值的90%。Kanamasa等[31]将A.aculealusCBHI的编码基因在米曲霉A.oryzae 表达系统得到高效表达，转化子中CBHI的浓度可以达到0.94 g/L。Wang等[32]克隆了Aspergillus niger的纤维二糖酶基因，并在瑞氏木霉中进行了表达，重组子的纤维二糖酶活性达到5.3 IU/mL，滤纸酶活性较宿主菌活性高44%，玉米杆糖化试验表明其水解效率较宿主菌提高了21%。

工业上，酵母是纤维素酶表达载体的首选菌。Zhuge等[33]在毕赤酵母中实现原核细菌的纤维素酶基因转化，多个纤维素酶基因共转化酵母，得到的工程菌表达产物的酶活有一定的提高。龚映雪[34]将绿色木霉中的纤维素酶基因EGⅢ和CBHⅡ，共转化酿酒酵母，获得能更有效降解非结晶纤维素的重组酵母菌株S.cerevisiae-EC。

3 结语

在各种高产纤维素酶菌种改良方法中，复合理化诱变方法由于具有效率高、流程简单等特点，是目前在发酵工业上获得产酶活性高、酶系分布全的纤维素酶菌株的有效手段，但它也存在盲目性和随机性等缺点。当前，原生质体融合技术、原生质体诱变技术、基因工程技术等随着现代生物技术的不断发展，改良筛选的突变株的产酶效率得到不断提高，逐渐成为菌种改良的主要手段。然而，目前原生质体融合技术还存在两大问题，即融合局限性（只局限于2个菌之间）和重组的随机性，存在染色体DNA的非同源性和对异源DNA的限制作用。原生质体诱变技术的应用随着新的诱变源离子束的出现，也有了新的进展。例如随着离子注入技术的出现，其与原生质体技术结合将会在优良菌株的改良中得到广泛的应用。虽然纤维素酶基因的克隆与表达取得了一定进展，但其目标蛋白质的表达和分泌均较弱，还不能大规模地应用于工业生产；通过基因工程构建表达高活性纤维素酶的工程菌已取得了肯定的实验室结果，但目前尚无工业应用的报道，所以目前并没有在真正意义上得到高效分解纤维素的工程菌，还需进一步开展应用研究。可见，选育和改良活性高、耐受性好、酶系均衡的高产纤维素酶菌株仍是当前研究的重点。随着生物技术的发展，对纤维素酶工程菌研究的逐渐完善以及纤维素酶解机理研究探索的不断深入，加之纤维素酶各级加工工艺的优化，将大大推动纤维素酶的市场化应用。

[1] 师德强, 王尧, 郭海燕, 等. 我国木质纤维生产乙醇的研发态势与科技需求[J]. 酿酒科技, 2015(8): 130-133.

[2] 高剑平, 张梁. 木质纤维原料生产燃料乙醇技术路线研究[J]. 长春工业大学学报（自然科学版）, 2013, 34(5): 542-545.

[3] Kamm B, Kamm M. Biorefineries-multi product processes[J]. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 2007, 105: 175-204.

[4] 中国科学院生物质资源战略研究组. 中国至2050年生物质资源科技发展路线图[M]. 北京: 科学出版社, 2009.

[5] 董桓. 纤维素酶和半纤维素酶高产菌株的筛选[D]. 保定: 河北大学, 2014.

[6] 吕珊珊, 侯运华, 闫孟节, 等. 工业真菌高效产酶突变技术与高产机制[J]. 中国生物工程杂志, 2016(3): 117-125.

[7] 方芳, 李相前, 赵玉萍, 等. 紫外-微波复合诱变选育高产纤维素酶的Trichoderma asperelloides菌株[J]. 中国饲料, 2015(2): 43-46.

[8] 曲音波. 木质纤维素降解酶系的基础和技术研究进展[J]. 山东大学学报（理学版）, 2011, 17(4): 18-21.

[9] Sudarshana Bandyopadhyay, Moumita Karmakar, Rina Rani Ray. Increase in endoglucanase productivity and mycelial stability of Rhizopus oryzae by classical mutagenesis[J]. British Biotechnology Journal, 2012, 2(2): 60-72.

[10] Javed M M, Ikram-ul-Haq, Mariyam I. Multistep mutagenesis for the over-expression of cellulase in humicola insolens[J]. Pakistan Journal of Botany, 2011, 43(1): 669.

[11] Dillon A J P, Bettio M, Pozzan F G, et al. A new Penicillium echinulatum strain with faster cellulase secretion obtained using hydrogen peroxide mutagenesis and screening with 2-deoxyglucose[J]. Journal of applied microbiology, 2011, 111: 48-53.

[12] Hungund B S, Gupta S G. Strain improvement of Gluconacetobacter xylinus NCIM 2526 for bacterial cellulose production[J]. African Journal of Biotechnology, 2010, 32(9): 5170-5172.

[13] 于春生, 张雨竹, 张风娇, 等. 紫外-氯化锂复合诱变哈茨木霉产生多菌灵抗药性菌株的研究[J]. 植物保护, 2015, 41(5): 85-90.

[14] 赵晓军, 任璐, 殷辉, 等. 黄瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）抗感嘧霉胺菌株胞外酶活性比较研究[J]. 山西农业大学学报（自然科学版）, 2014, 34(6): 31-33.

[15] 赵旭, 王文丽, 李娟, 等. 低温秸秆降解微生物菌剂的研究进展[J]. 生物技术通报, 2014(11): 55-61.

[16] El-Bondkly, Ahmed M, Aboshosha A A M, et al. Application and comparison of two different intraspecific protoplast fusion methods in Trichoderma harzianum and their effect on beta-glucosidase activity[J]. African Journal of Biotechnoloty, 2011, 10(52): 10683-10690.

[17] El-Bondkly A M, El-Gendy M M. Cellulase production from agricultural residues by recombinant fusant strain of a fungal endophyte of the marine sponge Latrunculia corticata for production of ethanol[J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 2012, 101(2): 331-346.

[18] Kaur B, Sharma M, Soni R, et al. Proteome-based profiling of hypercellulase producing trains developed through interspecific protoplast fusion between Aspergillus nidulans and Aspergillus tubingensis[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2013, 169(2): 393-407.

[19] 沈莹, 胡天觉, 曾光明, 等. 原生质体紫外诱变提高简青霉的木质素降解性能[J]. 中国环境科学, 2012, 32(3): 485-491.

[20] Xu F, Wang J, Chen S, et al. Strain improvement for enhanced production of cellulase in Trichoderma viride[J]. Prikl Biokhim Mikrobiol, 2011, 47(1): 61-65.

[21] Xu Feng, Jin Haojie, Li Huamin, et al. Genome shuffling of Trichoderma viride for enhanced cellulase production[J]. Annals of Microbiology, 2012, 62(2): 509-515.

[22] Gao Dongfang, Luan Yaqi, Wang Qian, et al. Construction of cellulose-utilizing Escherichia coli based on a secretable cellulase[J]. Microbial Cell Factories, 2015(14): 159.

[23] Somkid Deejing, Duangpen Dittamart. Isolation and screening of cellulase-producing microorganisms and the study of some characteristics of enzymes[M]. Biology Education and Research in a Changing Planet, 2015: 157-166.

[24] Larine Kupski, Fernanda Arnhold Pagnussatt, Jaqueline Garda Buffon, et al. Endoglucanase and total cellulase from newly isolated rhizopus oryzae and trichoderma reesei: Production, pharacterization, and phermal ptability[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2014, 172(1): 458-468.

[25] Liu Zhiguo, Sun Yanxia, Feng Tao, et al. Mammalian expression levels of cellulase and xylanase genes optimised by human codon usage are not necessarily higher than those optimised by the extremely biased approach[J]. Biotechnology Letters, 2014, 36(11): 2169-2176.

[26] He J, Yu B, Zhang K Y, et al. Expression of a Trichoderma reese β-xylanase gene in E.coli and activity of the enzyme on fiber-bound substrates[J]. Protein Expression and Purification, 2009, 1(63): 1-6.

[27] Zhang D H, Lax A R, Raina A K, et al. Differential cellulolytic activity of native-form and C-terminal tagged-form cellulase derived from Coptotermes formosanus and expressed in E.coli[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2009, 8(39): 516-522.

[28] Kim J O, Park S R, Lim W J, et al. Cloning and characterization of thermostable endoglucanase(Cel8Y) from the hyperthermophilic Aqui-fex aeolicus VF5[J]. Biophysical Research Communications, 2000, 279(2): 420-426.

[29] Arturo Huerta, Nestor Soler, Mariano Esperatti, et al. Importance of Aspergillus spp. isolation in acute exacerbations of severe COPD: Prevalence, factors and follow-up: The FUNGI-COPD study[J]. Respiratory Research, 2014(12): 15-17.

[30] Viikari L, Alapuranen M, Puranen T, et al. Thermostable enzymes in lignocellulose hydrolysis[J]. Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology, 2007, 108: 121-145.

[31] Kanamasa S, Mochizuki M, Takada G, et al. Overexpression of Aspergillus aculeatus cellobiohydrolase I in Aspergillus oryzae[J]. J Biosci Bioeng, 2003(95): 627-629.

[32] Wang B, Xia L. High efficient expression of cel1obiase gene from Aspergillus niger in the cells of Trichoderma reesei[J]. Bioresour Technol, 2011, 102(6): 4568-4572.

[33] Zhu G B, Du G C, Shen W, et al. Expression of a Bacillus subtilis pectate lyase gene in Pichia pastoris[J]. Biochemical Engineering Journal, 2008, 40(1): 92-98.

[34] 龚映雪, 台艳, 肖文娟. 酵母多基因表达载体在纤维素生物转化中应用[J]. 深圳大学学报（理工版）, 2010, 27(1): 82-86.

Research Progress on Efficient Enzyme Production Engineering Bacteria Breeding Technology of Cellulosic Ethanol Production

YAN Yu-ling1, YAO Xiu-qing1, ZHANG Quan2, CAO Chang-hai2

（1. Liaoning Shihua University, Fushun 113001, China; 2. Fushun Research lnstitute of Petroleum and Petrochemicals, SINOPEC, Fushun 113001, China）

The latest progresses in theoretical research and technology of breeding high cellulase producing strains were summarized. Breeding technologies of efficient enzyme bacteria for the production of cellulosic ethanol were summarized, such as to obtain efficient enzyme producing bacteria by composite physical and chemical mutagenesis, and all kinds of cellulase and hemicellulose strains could be modified by protoplast fusion, protoplast mutagenesis and gene engineering technology and so on. The prospects on breeding high cellulase producing strains in the future were presented.

lignocellulose; cellulase; strain; protoplast; mutagenesis; fusion; gene engineering

Q81；TK6

A

1004-8405(2016)04-0068-08

10.16561/j.cnki.xws.2016.04.02

2016-03-21

中国石油化工集团公司资助项目（213105）。

闫玉玲（1980～），女，在读博士；研究方向：纤维素生物质的综合利用。yulingyan1981@126.com