响应面-满意度函数优化重组大肠杆菌产NMN转移酶发酵条件

段琳琳， 李红梅， 何 海

上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 杨浦 200093

响应面-满意度函数优化重组大肠杆菌产NMN
转移酶发酵条件

段琳琳， 李红梅*， 何 海

上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 杨浦 200093

重组大肠杆菌Escherichaiacoli能高效表达NMN转移酶, 以此为出发菌株，以菌体生长量OD600和NMN转移酶的活力为响应值，对重组大肠杆菌产NMN转移酶的发酵条件进行优化。首先以Plackett-Burman实验设计优化筛选出3个主要影响因子：胰蛋白胨、甘油、MgSO4；随后以Box-Behnken中心组合设计建立上述3个因子对OD600和NMN转移酶活力水平的数学模型；最后通过满意度函数获得最佳发酵条件为：酵母粉30 g/L，胰蛋白胨10.5 g/L，甘油3.49 mL/L，MgSO40.45 g/L，K2HPO440.5 g/L，KH2PO46.0 g/L，NH4Cl 1.5 g/L，NaCl 0.6 g/L，接种量1.5%，诱导时间12 h。在该优化条件下，菌体生长和产酶水平均获得了显著的提升。重组NMN转移酶的活力水平从8.85 U/mg提高到15.48 U/mg，菌体生长量OD600从4.85提高到6.01，提高幅度分别为74.92%和23.92%。

NMN转移酶； 发酵优化； 满意度函数； 响应面法

NMN转移酶(Nmnat)作为生物体内唯一一种能催化合成NAD的生物酶，对于维持体内NAD水平至关重要[1]。研究发现在生物体内适量的表达Nmnat也可以使非本体蛋白质结构更加稳固，从而减少蛋白质聚合和损伤，并且可以清理毒性蛋白以减少蛋白质水解应激反应的发生。作为生物体内重要的“管家酶”，NMN转移酶在糖代谢、基因调控和肿瘤细胞治疗方面起到重要作用[2-3]。例如Nagase研究发现人类大脑中的Nmnat可延缓海马组织中与学习和记忆相关功能的衰退[4]。Nmnat还能使抗肿瘤药物6-巯基嘌呤在生物体内转化为ATP类似物，从而抑制NAD的合成，使细胞内NAD衰竭，最终导致癌细胞死亡[5]。

本课题组已成功构建出产NMN转移酶的重组大肠杆菌，并对其酶学性质及热稳定性进行了系统研究。为提高该工程菌的产酶水平，对该菌的培养基配方和发酵条件进行了优化。目前，响应面分析法是一种常见的培养基优化方法，它可以将体系目标响应值作为一个或多个因子的函数，精确研究因子与响应值之间的关系，从而确定多因子系统的最优发酵条件[6-7]。然而响应面法在多响应值优化中存在一定的局限性，难以寻求各响应值之间的均衡。为了合理、客观的进行多响应值之间的分析评价，Derringer等提出满意度函数法[8]，即通过特定的满意度函数将各响应值转化为0到1之间的数，实现多响应值向单响应值的转化，可以使各个响应值保持均衡并在某种意义上达到总体最优[9-10]。目前，响应面结合满意度函数法在微生物产酶条件优化的应用还较为少见。本研究采用响应面法结合满意度函数优化重组大肠杆菌发酵产NMN转移酶条件，旨在寻求菌体量与产酶能力的最佳组合，为后续的发酵放大试验提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

大肠杆菌E.coliBL21(DE3)由实验室保存。质粒载体pET30α(+)购自TaKaRa公司。E.coliBL21(DE3)pET30α(+)-Nmnat重组大肠杆菌由本实验室构建。异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自上海生工生物工程公司。酵母粉购自湖北安琪酵母股份有限公司。蛋白胨购自上海缘肽生物技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 培养基

种子培养基采用 LB 培养基(g/L): 胰蛋白胨 10.0，酵母膏 5.0，NaCl 10.0。

磷酸盐缓冲溶液(g/L): KH2PO423.1 g，K2HPO4125.4 g，121 ℃灭菌20 min。

发酵培养基采用TB培养基:胰蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，甘油4 mL/L，121 ℃灭菌20 min，待冷却至60 ℃后按体积比9∶1加入上述磷酸盐缓冲溶液。

固体培养基中琼脂添加量2%。培养基中均需添加终浓度为30 μg/mL的硫酸卡那霉素。

1.2 方法

1.2.1 种子培养

将确定重组成功表达的阳性单菌落pET30α(+)-Nmnat的单菌落接种于10 mL灭菌后的LB液体培养基中，在37 ℃，200 r/min振荡培养(8 h～12 h)，即为种子液。

1.2.2 发酵及产酶方法

种子液以1%接种量接入含卡那霉素抗性的100 mL TB液体培养基，当培养至OD600为0.5～0.7时，加入IPTG至终浓度为0.4 mmol/L，25 ℃，180 r/min诱导表达一定时间后，离心收集菌体。离心后的菌体用50 mmol/L 的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.5)重悬，超声破碎菌体(功率300 W，超声4 s，间隔6 s，超声60次)。破壁后菌液于4 ℃，12 000 r/min离心20 min，收集上清液备用。

1.2.3 NMN转移酶活力的测定

反应体系: 1 mol/L pH 7.5 Tris-HCl缓冲液，300 mmol/L NMN，50 mmol/L ATP，50 mmol/L Mn2+，乙醇2%，一定量的粗酶液，7U的ADH(乙醇脱氢酶)，混匀。置37 ℃恒温水浴中振荡反应2 h，加入0.155 mol/L的EDTA反应5 min，终止酶反应，反应液冰浴冷却，8 000 r/min离心1 min，取上清液并在340 nm处测定反应产物的吸光值OD340，计算Nmnat活力。酶活力计算公式如下：

(公式1)

其中，EW为OD340，V为反应体系的体积，mL;l为光程的距离，cm；蛋白质含量测定采用Bradford法。

酶活定义为：在37 ℃，1 mL反应体系中，每分钟催化得到1 μmol NMN的酶量为1 U。

1.2.4 Plackett-Burman实验设计

当影响因素较多时通常选用Plackett-Burman试验设计筛选显著因子[11]。选取酵母粉、胰蛋白胨、甘油、MgSO4、NH4Cl、NaCl、KH2PO4、K2HPO4、接种量、诱导时间作为PB设计的10个因素，每因素取2水平，高水平为低水平的1.5倍。为减少实验误差，等间距引进3个虚拟因子，分别为X4、X8、X12。通过比较各因素的显著水平，筛选出对菌体的生长量和酶活力影响显著的因子，采用Minitab 15.0设计PB试验序，进行试验分析，各因素及水平值见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计

1.2.5 最陡爬坡法的试验设计

分别以菌体生长量OD600和Nmnat活力为响应值，设计爬坡试验的方向和梯度，以确定响应面设计的中心点[12]。

1.2.6 Box-Behnken 试验设计

采用Box-Behnken 试验设计，以筛选出的3个因子进行优化处理，以最陡爬坡试验中最大响应值所对应的各因素值为响应面设计中心点，用Design Expert 8.0进行试验设计和分析，具体见下表2。

1.2.7 满意度函数

发酵过程中，微生物菌体量的增长和产酶水平提高之间不一定呈线性关系，故采用满意度函数法将多个响应值转化成单响应值优化，以期获得总体最优。满意度函数的平衡尺度d的范围为0～1，d=0说明响应值严重偏离目标值，d=1说明响应值与目标值接近。大肠杆菌的生长量OD600和Nmnat的活力都属于望大特性，其满意度函数定义为[13]：

表2 采用Box-Behnken 试验设计因素水平及编码

(公式2)

(公式3)

2 结果与分析

2.1 NMN转移酶生物合成模式的研究

按照1.2.2描述的培养方法，将重组大肠杆菌接种到初始培养基中，每隔1 h测OD600和Nmnat的酶活力大小，对大肠杆菌的生长和产Nmnat的生物合成模式进行研究，结果如图1所示。

从图中可以看出，1 h ～8 h是重组大肠杆菌的对数生长期，8 h后菌体生长进入稳定期。在加入诱导剂IPTG前，重组大肠杆菌产Nmnat较少，加入IPTG后，产酶量随着菌体的生长逐步提高；在菌体生长进入稳定期(8 h)后，酶活水平仍在上升，12 h时达到最大值，说明大肠杆菌产Nmnat与菌体生长存在部分耦合的关系，即Nmnat随着菌体的生长逐步合成，当菌体生长进入稳定期后，仍继续合成Nmnat。因此，在后续的优化研究中，需要寻求菌体生长和Nmnat的活力均衡以获得总体最优。

图1 重组大肠杆菌的菌体量增长与Nmnat酶活力间的关系

2.2 Plackett-Burman设计及结果分析

PB实验设计及结果见表3，以Nmnat活力和菌体生长量OD600为响应值的方差和显著性分析见表4和表5。一般P<0.05时，相应因素为显著影响因子[13]。根据表4可知，以Nmnat酶活为响应值时，甘油和MgSO4为显著影响因子，均为负效应；同理，根据表5，以菌体生长OD600为响应值时，胰蛋白胨和MgSO4为显著影响因子，其中胰蛋白胨为正效应，MgSO4为负效应。因此，在TB培养基的基础上，适当减小甘油和MgSO4的浓度有益于重组Nmnat的表达，而适当增加胰蛋白胨浓度，减小MgSO4浓度则有利于大肠杆菌的生长，其它因素影响效果不显著。因此，选择胰蛋白胨、甘油和MgSO4作为后续最陡爬坡实验和中心组合实验设计的显著影响因素。

2.3 最陡爬坡法试验结果分析

根据PB试验设计结果，通过增加胰蛋白胨、减小甘油和MgSO4浓度可提高产Nmnat能力和菌体的生长量，其它因素则遵循正效应取较高值，负效应取较低值的原则进行取值。结果如表6所示：利用4号培养基进行发酵生产获得的Nmnat比活和菌体生长量OD600均最大。从4号开始，Nmnat比活和OD600均降低，说明培养基中适量的氮源，碳源和硫酸盐有助于Nmnat的重组表达和菌体生长，因此选用4号培养基为Box-Behnken 实验设计的中心点。

表3 PB实验设计及结果

表4 以Nmnat为响应值的PB设计方差及显著性分析

注：*表示差异显著(P<0.05)

表5 以OD600为响应值的PB设计方差及显著性分析

表6 最陡爬坡实验设计及结果

2.4 Box-Behnken 试验结果方差分析及满意度分析

Box-Behnken 实验设计与结果分析见表7，利用Design Expert 8.0对数据进行分析和多元回归拟合，建立以Nmnat活力、OD600和总体满意度D为目标函数的二次回归方程，并对回归方程进行方差分析和显著性检验(表8～10)。

总体满意度函数：根据Box-Behnken试验设计结果，取公式(2)中Y1,min=10.5,Y1,max=15.0；Y2,min=4.7,Y2,max=6.1

以Nmnat酶活为响应值的满意度函数为：

(公式4)

以OD600为响应值的满意度函数为：

(公式5)

D=d1(Y1)0.7×d2(Y2)0.3

(公式6)

表7 Box-Behnken 试验设计及结果

2.4.1 以Nmnat酶活为响应值的方差分析

Nmnat活力(Y1) 与胰蛋白胨(X2)、甘油(X3)和MgSO4(X5)的二次多项回归方程如下所示：

Y1=35.104-4.496X2+ 0.394X3+15.593X5-0.043X2X3+0.455X2X5+1.893X3X5+ 0.202 X22-0.154 X32-52.615X52

表8方差分析显示，该回归模型显著(P<0.05)，说明酶活力与各个变量之间存在显著的线性相关，失拟性在置信区间95%水平上不显著(P=0.465>0.05)，即方程失拟度较小，可以利用模型预测响应值Nmnat与变量之间的关系。其中，一次项X2、X3、X5都不显著，说明单一的各因素对NMN转移酶比活没有显著影响；交叉项X2X3显著，X2X5和X3X5不显著，说明X2(胰蛋白胨)和X3(甘油)对Nmnat比活有显著交叉影响；二次项X22、X32显著。

表8 以Nmnat酶活为响应值的回归方程方差分析及显著性检验

注：R2= 90.4%(调整R2= 70.76%)

2.4.2 以OD600为响应值的方差分析

OD600(Y2)与胰蛋白胨(X2)、甘油(X3)和MgSO4(X5)的二次多项回归方程如下所示：

表9方差分析显示，该回归模型极显著(P=0.008<0.01)，说明响应值OD600与各个变量之间存在极显著的线性关系；失拟性在置信区间95%水平上不显著(P=0.962>0.05)，说明方程在回归模型的拟合度好，可以实际预测响应值(OD600)与变量之间的关系。其中，一次项X3显著(P<0.05)，说明甘油浓度对OD600有显著影响；交叉项X2X3显著，X2X5和X3X5不显著，说明X2(胰蛋白胨)和X3(甘油)对OD600有显著交叉影响；二次项X32显著，X22和X52不显著。

表9 以OD600为响应值的回归方程方差分析及显著性检验

R2=84.8%(调整R2=72.13%)

2.4.3 以总体满意度D为响应值的方差分析

以总体满意度D为响应值的方差分析如表10所示，该模型显著(P<0.05)，说明方程在响应值与变量之间存在显著的线性关系；失拟性在置信区间95%水平上不显著(P=0.574 > 0.05)，即失拟度较小，实验误差在可接受范围之内，说明该模型可以用于预测总体满意度与变量之间的情况。多响应值转化为单响应值即总体满意度D，利用响应面法求解D，得到理论最大总体满意度为1.028，此时对应的理论最优发酵条件为胰蛋白胨10.5 g/L，甘油3.49 mL/L，MgSO40.45 g/L，相应的理论Nmnat酶活为15.48 U/mg，OD600为6.04。由表7可知，以Nmnat酶活最大响应值14.84 U/mg所对应的菌体生长量OD600为5.62进行满意度计算，此时满意度D1为1.026；而以菌体生长量OD600最大响应值6.02所对应的Nmnat酶活为12.79 U/mg进行满意度计算，满意度D2为0.729，均低于理论最大总体满意度1.208。这说明满意度函数法能合理在多响应值之间取得均衡，适用于多响应值的优化。

表10 以总体满意度D为响应值的回归方程方差分析及显著性检验

2.5 最佳条件的验证试验

为检验响应曲面法和满意度函数法所得结果的可靠性，采用上述优化发酵条件，进行3次平行试验，结果测得Nmnat比活为(15.45±0.02) U/mg，OD600为6.01±0.03，与预测值基本一致，说明通过上述实验方法得到的最优发酵条件是可靠的，具有一定参考价值。

3 结论

本研究利用数学统计方法，将响应面与满意度函数相结合，对重组大肠杆菌产Nmnat的发酵条件进行了优化，结果如下：

(1)PB实验设计结果显示，在初始TB培养基的基础上，适当增加胰蛋白胨浓度，减小MgSO4的浓度，对重组大肠杆菌产Nmnat以及菌体的生长有一定的促进作用。

(2)通过满意度函数法将多响应值化问题转化为单响应变量优化，获得总体最优，所得最优发酵培养基为酵母粉30 g/L，胰蛋白胨10.5 g/L，甘油3.49 mL/L，MgSO40.45 g/L，K2HPO440.5 g/L，KH2PO46.0 g/L，NH4Cl 1.5 g/L，NaCl 0.6 g/L，接种量1.5%，诱导培养时间12 h。在该优化条件下，菌体生长量OD600为6.01，Nmnat酶活由8.85 U/mg提高到15.48 U/mg，提高幅度达74.92%。运用响应面与满意度函数相结合的优化方法显著提高了该重组大肠杆菌的产酶水平，同时为多响应值的发酵优化提供了参考。

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Optimization of NMN adenylyltransferase production by recombinant Escherichia coli using response surface methodology coupled with desirability function

DUAN Lin-lin, LI Hong-mei, HE Hai

University of Shanghai for Science and Technology, School of Medical Instrument and Food Engineering,Yangpu 200093,Shanghai，China

The fermentation conditions of NMN adenylyltransferase production by recombinantEscherichiacoliwere optimized. Biomass yield (OD600) and NMN adenylyltransferase activity were selected as response value during fermentation condition optimization. Peptone, glycerin and MgSO4were screened to be the three key components using Plackett-Burman design method. Then, the mathematical model reflecting the three main factors and the production level of enzyme was established by using the Box-Behnken design method. Finally, a satisfactory degree function was defined and the satisfactory solution was obtained. The final optimal fermentation conditions were: yeast extract 30 g/L, peptone 10.5 g/L, glycerol 3.49 mL/L, MgSO40.45 g/L, K2HPO440.5 g/L, KH2PO46.0 g/L, NH4Cl 1.5 g/L, NaCl 0.6 g/L, inoculum size of 1.5% and induction time of 12 h. After the validated experiment under above conditions, enzyme production and biomass of recombinant strain were increased by 74.92% and 23.92%, respectively.

NMN adenylyltransferase; fermentation optimization; desirability function; response surface methodology

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.06.008

段琳琳(1990～)，女，硕士研究生。研究方向：微生物资源利用。E-mail:duanlinlin0303@163.com。

*通信作者: 李红梅，博士，硕士生导师。Tel：021-55271117，E-mail: sunnysand@126.com。