卫矛茎段组织培养中消毒方法及不定芽诱导1)

赵丽蒙 陆秀君 张丽杰 方诗雯

(沈阳农业大学，沈阳，110866)



卫矛茎段组织培养中消毒方法及不定芽诱导1)

赵丽蒙 陆秀君 张丽杰 方诗雯

(沈阳农业大学，沈阳，110866)

以卫矛(Euonymusalatus(Thunb.) Sieb.)茎段为外植体，通过在4—9月不同时间取材，并采用升汞和次氯酸钠不同处理时间、升汞结合吐温、紫外线照射等消毒方法，筛选外植体最佳取材时间和最佳消毒方法；同时，研究了不同质量浓度的激素和琼脂对不定芽诱导的影响，并采用L9(34)正交试验设计，探讨MS、B5、White不同培养基和不同质量浓度的6-BA、NAA、GA3对不定芽增殖的影响，筛选出不定芽诱导和增殖的最佳培养基。结果表明：5月中旬为茎段的最佳取材时间；HgCl28 min并加入两滴吐温-20为消毒的最佳方法；MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.05 mg/L+琼脂7.0 g/L是卫矛茎段不定芽诱导的最佳培养基，诱导率高达70.67%；在正交试验的9个处理中，以MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.05 mg/L的增殖系数最高为19.25，通过极差分析得出MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.05 mg/L是卫矛不定芽增殖的最佳培养基，增殖系数为23.51。

卫矛；茎段；取材时间；组织培养；不定芽诱导

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(12)：21-25,63.

We used theEuonymusalatusstem segment as explants to study the effects of different sampling time on the disinfection of explants between 4 to 9 months, and the effects of different disinfection methods on the disinfection of stem segment, including mercuric chloride and sodium hypochlorite different processing time. We also studied the effect of hormone and agar in different concentrations on adventitious bud induction. Through L9(34) orthogonal test, we studied the effect of the MS, B5, White, and different concentration of 6-BA, NAA and GA3on the adventitious buds proliferation, and we finally chose out the optimum culture medium for adventitious bud induction and proliferation. Mid-May is the best sampling time ofEuonymusstem segments; mercuric chloride combined with two drops of tween-20 for 8 min is the best method forEuonymusstem segments sterilization; MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+agar 7.0 g/L is the best culture medium forEuonymusstem segments of adventitious bud induction, adventitious bud induction rate reaches 70.67%; Among nine procedures in orthogonal test, the proliferation coefficient is the highest (19.25) in the first processing. MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA0.05 mg/L is the optimum culture medium for adventitious bud proliferation inEuonymuswith the proliferation coefficient of 23.51.

卫矛(Euonymusalatus(Thunb.) Sieb.)是卫矛科(Celastraceae)卫矛属(EuonymusL.)落叶灌木，又名鬼箭羽、见肿消、千层皮等。其株形密集，秋叶紫红色，假种皮橘红色，极具观赏价值，为重要的野生观叶观果的灌丛。同时，卫矛根、皮均可入药，具有破血、杀虫、通经、散疲止痛等功效和调血脂、降血糖、延缓动脉粥样硬化等作用，近年来我国临床上用于治疗糖尿病已取得显著效果[1]，卫矛在韩国和日本也多用于对抗肿瘤[2-3]，具有很好的药用价值。现如今卫矛已在欧洲普遍栽培，中国虽然除新疆、青海、西藏、广东及海南以外，各地均有分布，但是种植却不普遍，还有待开发培育。

由于卫矛种子具有假种皮，种子内含油量高，休眠期长[4]，生产中获得卫矛实生苗难度大。而传统的扦插、嫁接等无性繁殖技术，繁殖系数低、速度慢、品质易退化、且操作比较困难等，无法规模化生产以满足市场的需求。植物组织培养技术，却能很好的解决这一难题。现已有学者对卫矛科部分植物进行了组织培养研究，如陕西卫矛[5]、金叶卫矛[6]、火焰卫矛[7]、爬行卫矛[8]、胶东卫矛[9]等。然而至今为止并没有学者对卫矛的组织培养进行研究，因而卫矛组织培养技术还有待开发。在组织培养中不定芽诱导途径具有很高的繁殖系数。本试验便以卫矛茎段为外植体诱导不定芽，再通过不定芽增殖获得丛生芽，以期为卫矛快繁体系建立提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

卫矛茎段外植体取自沈阳农业大学后山自然生长状态下的野生实生苗。2015年4—9月中旬，选取某一个晴天，在14:00左右，在2～3年生长势良好的植株上选取具有3～5个节间并且长势良好的当年生枝条若干，置于自封袋内带回实验室。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理

将枝条剪去叶片，并剪成2 cm的带芽茎段，放在流水下冲洗10 min，以去除表面脏物；再用1 g/L的洗衣粉水浸泡30 min，同时用毛笔不断刷洗茎段的腋芽处，进行深层清理；流水再冲洗2 h；用干净滤纸吸干水分，移至超净工作台备用。在超净工作台内，用75%酒精表面消毒30 s，无菌水洗3次，之后使用HgCl2等消毒液消毒，无菌水冲洗5次备用。

1.2.2 外植体最佳取材时间

分别于4—9月的中旬选取外植体，使用同样的消毒方法进行消毒(0.1% HgCl25 min)。将消毒后的茎段切去材料与药液接触的伤口后，接种于MS空白培养基中，其中添加蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L，pH为5.8。培养室温度(24±1)℃，空气相对湿度50%～60%，光照时间16 h/d，光照强度2 000～3 000 lx。每处理20个外植体，重复3次。培养15 d后，统计污染数、死亡数、存活数，进而计算外植体污染率、死亡率、存活率。

1.2.3 外植体适宜消毒方法

对8月份采集的外植体进行预处理后，用75%酒精表面消毒30 s，无菌水洗3次后采用7种不同消毒方法进行消毒。1)0.1% HgCl26 min；2)0.1% HgCl27 min；3)0.1% HgCl28 min；4)1% NaClO 20 min；5)1% NaClO 30 min；6)使用加入的0.1% HgCl2+吐温-20(每50 mL HgCl2中加入1滴吐温)消毒8 min；7)将外植体用紫外线直射10 min，然后使用0.1% HgCl2消毒6 min。进行完以上消毒后，再用无菌水冲洗5次。将得到的外植体接种在添加蔗糖30 g/L、琼脂7 g/L的MS空白培养基上，每处理20个外植体，重复3次。培养15 d后，统计污染数、死亡数、存活数，进而计算外植体污染率、死亡率、存活率。

1.2.4 不定芽诱导培养基筛选

将获得的无菌外植体转接到下列诱导培养基中：MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+琼脂6.5 g/L；MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+琼脂7.0 g/L；MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.05 mg/L+琼脂6.5 g/L；MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.05 mg/L+琼脂7.0 g/L，每种培养基添加蔗糖30 g/L。每处理20个外植体，重复3次。观察不定芽诱导情况，培养60 d后，统计不定芽发生的外植体总数和芽数。

1.2.5 不定芽增殖培养基筛选

选用L9(34)正交表选取3种基本培养基、6-BA、NAA、GA34个因子，每个因子3个水平(见表1)。

将诱导出的不定芽分离成单个小芽，接种在不同的培养基中，每处理20个外植体，重复3次。观察不定芽增殖情况，培养60 d时，统计芽数、芽长。

表1 不定芽增殖培养基筛选的正交试验设计

1.3 数据分析

污染率=(污染的外植体数/接种的外植体总数)×100%。

死亡率=(死亡的外植体数/接种的外植体总数)×100%。

存活率=(存活的外植体数/接种的外植总体数)×100%。

诱导率=(诱导出不定芽的外植体数/接种的外植总体数)×100%。

增殖系数=不定芽总数/起始芽数。

使用Excel 2003对所得数据进行记录和统计，使用SPSS17.0软件对数据进行处理，采用Duncan多重比较法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 取材时间对外植体消毒的影响

以不同取材时间的卫矛茎段为外植体，采用同样的消毒方法，接种在MS空白培养基中，其消毒效果会因取材时间的不同而不同(表2)。

表2 不同取材时间对外植体消毒的影响

注：表中数据为平均值±标准差;同列不同大写字母表示在0.01水平差异极显著，同列不同小写字母表示在0.05水平差异显著。

从4月中旬到9月中旬，随着取材月份的增加，外植体染菌率逐渐上升，由4月的0.33%到9月的99.67%，而死亡率却逐渐下降，由35.33%到0.33%。但是存活率在5月中旬是最高的达76.67%，而4月中旬存活率仅达64.33%，而5月中旬时其染菌率也很低(3.00%)，此时外植体抵抗灭菌剂伤害的能力也逐渐增强，死亡率相对于4月中旬有所降低。之后的6、7月份正值夏季多雨，微生物较多，染菌率较高，达30%左右，存活率在50%左右。而8、9月份，染菌率接近100%，可见外植体在自然状态下暴露的时间越长，其上的微生物越多，其灭菌的难度越高，但同时其抵抗灭菌剂伤害的能力也很强。因此根据染菌率和死亡率这两方面的整体情况，可以得出5月中旬是外植体取材进行消毒处理的最佳时期。

2.2 消毒方法对外植体消毒的影响

消毒方法、消毒剂和消毒时间不同，其外植体的染菌率、存活率也不同(表3)。

表3 不同消毒方法对外植体的影响

注：表中数据为平均值±标准差；同列不同大写字母表示在0.01水平差异极显著，同列不同小写字母表示在0.05水平差异显著。

次氯酸钠的消毒效果次于HgCl2，使用1% NaClO消毒20、30 min对外植体灭菌效果毫无影响，染菌率都为100%。而使用0.1% HgCl26 min，染菌率就有显著的降低(50.33%)。然而当HgCl27、8 min时，染菌率并未有多大改善，然而随着HgCl2消毒时间的加长，外植体的死亡率也在逐渐增加(6.33%、14.67%、17.67%)。这主要是因为过长的消毒时间会对外植体造成伤害，因此在考虑降低污染率的同时，也应该考虑到由灭菌剂所造成的死亡率。而从外植体存活率指标来看，单独使用HgCl26 min时，存活率达43.33%，并不理想。为了更好的控制染菌率，本试验采用了紫外线直射外植体10 min后，再用HgCl26 min，这种办法确实有效的降低了染菌率(15.33%)，但其死亡率却大大的增加了(66.67%)，存活率也仅有18.00%，可见紫外线对外植体的伤害非常大。HgCl2加2滴吐温8 min的染菌率(17.67%)与单独使用HgCl28 min的染菌率(44.67%)相比降低了一半多，这是因为吐温作为表面活性剂，可以使HgCl2和外植体表面接触的更充分，加快消毒进程，消毒效果较好，从而使外植体的存活率达到了峰值59.67%，因此HgCl2与2滴吐温一同作用消毒8 min为外植体消毒的最佳方法。

2.3 卫矛茎段不定芽诱导

以MS为基本培养基，通过添加不同质量浓度的6-BA和NAA对获得的无菌茎段进行不定芽诱导，结果见表4。

表4 不同培养基对卫矛茎段不定芽诱导的影响

注：表中数据为平均值±标准差；同列不同大写字母表示在0.01水平差异极显著，同列不同小写字母表示在0.05水平差异显著。

在对不定芽诱导时观察到，茎段外植体在培养10 d左右时茎段中部开始发育出浅绿近透明状的愈伤组织(图1，a)，之后愈伤颜色逐渐加深(图1，b)，在培养了40 d左右外植体的褐色愈伤中开始长出不定芽(图1，c)。试验结果表明，在添加了6-BA2.0 mg/L和NAA0.05 mg/L的培养基中培养的外植体的不定芽的诱导率(62.33%、70.67%)和平均芽数(4.87、5.60)均高于添加了6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L的培养基，细胞分裂素与生长素的比越高越有利于不定芽诱导。在1和3处理中，所获得的不定芽均为浅绿色(图1，d)，在2和4处理中所获得的不定芽深绿色且长势较好，这是因为2、4处理中琼脂浓度为7.0 g/L，1、3处理中琼脂浓度为6.5 g/L，琼脂质量浓度较高时，可束缚住水分，减少外植体对水分的吸收，使叶绿素浓度有所提高，颜色深绿，长势较好。因此，MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.05 mg/L+琼脂7.0 g/L是卫矛茎段不定芽诱导的最佳培养基，其诱导率达70.67%，平均芽数达5.60个(图1，e)。

2.4 卫矛茎段不定芽增殖

将诱导出的不定芽分离成单一的小芽，接种在增殖培养基中，每个处理使用了不同的培养基类型，并添加了不同质量浓度的6-BA、NAA、GA3。9组试验的增殖系数分别为19.25、14.50、13.00、2.75、10.50、8.75、1.00、1.10、1.00。培养基类型和不同质量浓度的激素对不定芽增殖均有很大影响，试验结果极差分析见表5。

a.培养10 d愈伤浅绿色;b.培养20 d愈伤黄褐色;c.培养40 d后不定芽;d.琼脂6.5 g/L时不定芽浅绿色;e.最佳处理方法不定芽平均为5.6个。

极差A(培养基类型)B(6-BA)C(NAA)D(GA3)K146．7523．0029．1030．75K222．0026．1018．2524．25K33．1022．7524．5016．85k115．587．679．7010．25k27．338．706．088．08k31．037．588．175．62R14．551．123．624．63

注：K1、K2、K3对应的数值分别代表每个因素各个水平下的增殖系数的总和；k1、k2、k3对应的数值分别代表每个因素各个水平下的增殖系数的平均值；R为极差，即每因素下的平均极大值与平均极小值的差。

从表5可知，基本培养基、6-BA、NAA和GA3这4种因素均对增殖系数有影响，由R值(因素内水平极差)大小可以看出各因素对试验结果的影响程度。这4因素对卫矛不定芽增殖系数的影响由主到次依次为A、D、C、B，即基本培养基、GA3、NAA、6-BA。在以上9个处理中，以含高无机盐成分的MS为基本培养基的3个处理中的不定芽增殖系数分别为19.25、14.50、13.00(图2A，B，C)，均远远高于其他两种，且长势良好，均为深绿色芽；而以含低无机盐成分的White为基本培养基的3个处理中的芽数几乎相同，且不定芽长势较弱，为浅黄绿色(图2D)。较低质量浓度的生长素有利于诱导不定芽增殖，而细胞分裂素质量浓度过高或过低都会对增殖有抑制作用，由正交数据分析中也得出NAA为0.05 mg/L、6-BA为1.0 mg/L时的增殖系数较高。在GA3的3个水平当中，随着GA3的质量浓度的增大，增殖系数却逐渐在减小(8.08、5.62、4.63)，可见赤霉素对不定芽增殖有一定的抑制作用，因而由正交表分析出最优组合为A1B2C1D1，即MS+NAA0.05 mg/L+6-BA1.0 mg/L。在对正交试验结果验证时所获得结果与正交分析结果一致，在这个培养基上获得的增殖系数高达23.51(图2E)，因而MS+NAA0.05 mg/L+6-BA1.0 mg/L为卫矛不定芽增殖的最佳培养基。

3 结论与讨论

本研究发现取材季节和时间不同对灭菌效果的影响很大。春季空气干燥，阳光充足，不利于微生物滋生，外植体消毒效果较好，夏季虽然光照充足但降雨量多，微生物伴着雨水附着在外植体表面，灭菌困难，而秋季气温高、湿度大，更利于微生物滋生和蔓延，较难灭菌[10]。同时外植体在自然状态下暴露时间越长，外植体表面附着的微生物越多，染菌率越高。吴群英等[11]在以青钱柳(Cyclocaryapaliurus.)嫩枝茎段为外植体进行不定芽诱导时，发现茎段外植体宜在春季取材，5月份为最佳的取材时期[12]。紫外线能够穿透微生物的细胞膜和细胞核并且破坏DNA，使其失去复制能力或活性[13]，因而紫外灯照射能抑制附着在卫矛茎段表面真菌、细菌的快速繁殖，具有很好的灭菌效果，但其同时对植物的危害也不容小觑，紫外线照射在降低灭菌率的同时也提高了死亡率，因而不易用于外植体消毒。吐温作为表面活性剂，可使灭菌更彻底，染菌率低，成活率高。在红腺忍冬(Lonicerahypoglauca)[14]和锥栗(Castaneahenryi)[15]的消毒过程中得出吐温和HgCl2结合为外植体消毒的最佳方法。与本研究得出吐温-20和HgCl2的结合使用可大大降低染菌率这一结果相似。

A.处理1，MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.05 mg/L+GA30 mg/L;B.处理2，MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+GA31.0 mg/L;C.处理3，MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+GA32.0 mg/L;D.处理9中不定芽的生长状况;E.正交最优组合中丛生芽生长状况。

图2 培养60d后不定芽增殖情况

植物组织培养中，不定芽诱导最常用的细胞分裂素和生长素是6-BA和NAA[16]。本研究发现激素质量浓度配比较高时，不定芽诱导率也较高，不定芽数也较高。这表明高细胞分裂素低生长素有利于不定芽的形成。张娜[17]在文冠果(XanthocerassorbifoliumBunge)不定芽研究中也得出类似结论，6-BA与NAA质量浓度比值为20∶1时的诱导率高于质量浓度的10∶1，随着NAA质量浓度的升高，激素配比降低，不定芽诱导率和每个外植体产生的芽数也呈下降趋势。

本研究还发现基本培养基类型对不定芽增殖的影响最大，其影响程度：MS>B5>White，这是由于每种基本培养基的含盐成分及质量浓度不一样，对于卫矛来说，最喜含钾盐、铵盐、硝酸盐质量浓度较高的MS培养基；而仅硝酸盐含量较高的B5培养基则不能够提供卫矛所需要的一些基本营养；各类无机盐含量均较低的White培养基更加不能提供卫矛所需的营养成分，长势很差。张倩等[18]在对薄荷(Menthahaplocalyx)茎段诱导时也发现MS培养基的诱导效果优于B5培养基。由此可见，培养基中无机盐种类及浓度是组织培养中最关键的因素。赤霉素对不定芽增殖的影响仅次于培养基类型，虽然GA3具有促进植物茎叶生长的作用，但它对不定芽的增殖却有一定的抑制作用，由于赤霉素作用在外植体生长时，促进细胞纵向分化，抑制了细胞横向分化，因而抑制了不定芽的形成。在本研究中6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L为不定芽增殖的最佳的激素配比。因为在增殖过程中，若6-BA质量浓度过高则会对不定芽增殖有一定的抑制作用，如若不添加NAA，则会导致芽体弱小，叶片黄花[19]，N.AhamedSherif等[20]在金线莲(AnoectochiluselatusLindley)的研究中也认为细胞分裂素与低质量浓度的生长素结合对增殖的效果是最好的。

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Adventitious Bud Induction in Tissue Culture from Stem Segment ofEuonymusalatus(Thunb.) Sieb

Zhao Limeng, Lu Xiujun, Zhang Lijie, Fang Shiwen

(Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, P. R. China)

Euonymusalatus; Stem segment; Sampling time; Tissue culture; Adventitious bud induction

赵丽蒙，女，1993年5月生，沈阳农业大学林学院，硕士研究生。E-mail:1076222612@qq.com。

陆秀君，沈阳农业大学林学院，教授。E-mail:lxjsyau@126.com。

2016年5月24日。

S715.3

1)辽宁省农业科技攻关项目(2014207005、2011207003)。

责任编辑：潘 华。