枸杞多糖通过氧化应激途径促海绵体神经再生的实验研究

丁协刚，刘 波,2，李世文，王行环

(1.武汉大学中南医院泌尿外科，湖北武汉 430071；2.湖北医药学院附属十堰市太和医院泌尿外科，湖北十堰 442000)

·基础研究·

枸杞多糖通过氧化应激途径促海绵体神经再生的实验研究

丁协刚1，刘 波1,2，李世文1，王行环1

(1.武汉大学中南医院泌尿外科，湖北武汉 430071；2.湖北医药学院附属十堰市太和医院泌尿外科，湖北十堰 442000)

目的 探讨氧化应激在枸杞多糖(lyciumbarbarumpolysaccharides，LBP)促海绵体神经(cavernousnerves，CN)钳夹损伤后再生中的作用。方法 84只雄性SD大鼠随机平均分成3组，即假手术组、CN损伤对照组、LBP处理组。LBP处理组于术后第1天开始，连续灌胃2周。分别于术后1周、2周、4周、12周每组随机取7只大鼠行血清丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性测定，术后12周电刺激CN测定海绵体内压，随后取CN进行甲苯胺蓝染色记录神经有髓鞘轴突数目。结果 在术后第1、2和第4周，LBP组超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性显著高于假手术组及损伤对照组；在术后第2周和第4周，LBP处理组MDA含量明显低于假手术组及损伤对照组；术后12周LBP处理组平均海绵体内压、CN横切面有髓鞘轴突数目均明显高于损伤对照组，但均低于假手术组。结论LBP可通过减轻CN钳夹损伤后的氧化应激来促进CN神经再生及勃起功能的恢复。

枸杞多糖；勃起功能障碍；海绵体神经

我们前期的研究表明，枸杞多糖(lyciumbarbarumpolysaccharides，LBP)可以在一定程度上促钳夹损伤海绵体神经的再生[1]。为进一步阐述其机制，本实验将LBP用于双侧CN钳夹损伤后的大鼠，通过血清氧化应激指标的检测和与勃起功能相关的形态学和功能学指标检测，探讨LBP是否通过其抗氧化机制促进CN再生修复和勃起功能恢复。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂 甲苯胺蓝(上海试剂三厂)；还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2′-磷酸(nicotinamideadeninedinucleotide2′-phosphate，NADPH)、硝基四氮唑蓝(nitrotetrazoliumblue，NBT)、TritonX-100(美国Sigma公司)；OCT包埋剂、EM812包埋剂(北京中杉生物试剂公司)；丙二醛试剂盒、超氧化物歧化酶试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)。枸杞多糖在武汉大学公共卫生学院营养学系实验室制备，参照我们前期的提取方法[2]，用前将枸杞多糖用生理盐水稀释，配成1mg/mL的溶液，4 ℃保存。

1.2 主要设备SXP-1C型手术显微镜(上海医用仪器厂)；HC-X020显微血管夹(宁波市成和显微器械厂)；BL420-F生理记录仪(成都泰盟科技有限公司)；超薄切片机(德国Leica公司)；CM1900恒冷式冰冻切片机(瑞典LKB公司)；OLYMPUS-DP12显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.3 实验动物及分组 84只SPF级雄性SD大鼠，体重250～300g，购于武汉大学实验动物中心，许可证号：SCXK(鄂)2008-0004，均经性交配实验证实有正常性功能。随机均分为假手术组、损伤对照组及LBP组，每组28只。

1.4 动物模型的建立 在无菌状态下，大鼠经 1%戊巴比妥(50mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于鼠台上，取下腹正中切口，延长至阴茎根部，在外科手术显微镜(SXP-1B型，上海医用仪器厂)下于两侧前列腺背外侧找到盆神经节及海绵体神经，用显微器械游离海绵体神经后，参照我们前期的模型制作方法[3]，用显微血管夹钳夹两侧海绵体神经各2min后逐层关腹。假手术组仅游离海绵体神经而避免损伤。LBP组于术后第1天起每天按10mg/kg剂量行LBP灌胃,连续灌胃2周，对照组及假手术组灌胃给予同体积的生理盐水。

1.5 氧化应激指标测定 分别于术后第1、2、4、12周每组各随机取7只大鼠，经心脏采血提取血清，测定大鼠血清丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽过氧化物酶活性，评价氧化应激水平。术后12周大鼠先行勃起功能测定再行心脏采血。

1.6 阴茎海绵体内压测定 术后3个月，各组大鼠再次用1%戊巴比妥(50mg/kg)经腹腔注射麻醉。再取下腹正中切口，在手术显微镜下找到CN并将其游离，然后延长下腹切口暴露出阴茎脚。用连接在生物机能实验系统(BL420-F，成都泰盟科技有限公司)上的间距约1mm的双极电极勾住CN，在阴茎脚处插入1只22号蝶形针头，通过PE-50硅胶管连接压力换能器，设置电极刺激参数为连续单刺激，电压5V，波宽5ms，频率20Hz，电刺激CN持续60s，记录海绵体内压(intracavernouspressure，ICP)变化曲线。

1.7 海绵体神经甲苯胺蓝染色 压力测定完成后，立即取钳夹处远端3mm的海绵体神经，置于2%的戊二醛磷酸盐缓冲液(pH7.4)中前固定，2%的饿酸后固定，梯度酒精脱水，环氧树脂(Epon-812)定向包埋，中点半薄横切片1μm厚，经1%甲苯胺蓝染色，在OLYMPUS-DP12显微镜下放大400 倍拍片，观察CN整个横切面有髓鞘轴突的数目。

1.8 统计学分析 各组实验数据均以平均数±标准差表示，采用SPSS13.0软件行单因素方差分析和t检验统计分析，P<0.05表示有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清氧化应激水平 如表1所示，术后第1周，3组大鼠血清丙二醛水平无显著性差异，在第2周及第4周，LBP组丙二醛含量明显低于假手术组及钳夹损伤组(P<0.05)。如表2、表3所示，在术后第1、2周和第4周，LBP组超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性明显高于其他两组(P<0.05)；但在术后12周，3组大鼠间血清丙二醛含量、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性差异均无统计学意义。

表1 各组大鼠在术后不同时间血清丙二醛含量 (nmol/mL)

与假手术组和损伤对照组比较，*P<0.05。

表2 各组大鼠在术后不同时间血清超氧化物歧化酶活性 (U/mL)

组别 第1周 第2周 第4周 第12周假手术组44.72±11.2351.23±12.8554.26±11.5967.48±12.16损伤对照组41.29±11.5445.71±11.1350.64±12.9765.53±12.35LBP组78.54±12.29*86.98±13.26*75.04±14.28*67.02±12.59

与假手术组和损伤对照组比较，*P<0.05。

表3 各组大鼠在术后不同时间血清谷胱甘肽过氧化物酶活性 (U/mL)

组别 第1周 第2周 第4周 第12周假手术组124.52±13.14129.96±15.53138.41±16.55151.16±18.76损伤对照组120.35±15.91125.31±14.48133.22±17.18151.82±16.29LBP组163.79±16.17*179.41±17.36*159.24±17.63*152.02±17.39

与假手术组和损伤对照组比较，*P<0.05。

2.2ICP测定结果LBP组ICP值(82.8±8.9)mmHg显著高于损伤对照组[(48.6±6.1)mmHg，P<0.05]，但低于假手术组[(125.6±9.8)mmHg，P<0.05]。

2.3 海绵体神经甲苯胺蓝染色结果 假手术组(图1A)CN横切面有丰富的有髓鞘轴突，轴突排列整齐，结构完整，外观形态正常，而损伤对照组(图1B)轴突排列紊乱，轴突粗细不一。LBP组(图1C)与损伤对照组相比，轴突数目显著再生，轴突排列、轴突大小均趋向于正常外观。LBP组有髓鞘轴突数目为(106.8±17.9)，明显高于损伤对照组(64.9±13.86，P<0.05)，但低于假手术组(180.9±15.3，P<0.05)。

图1 各组海绵体神经干甲苯胺蓝染色(×1 000)

A：假手术组；B：钳夹损伤组；C：枸杞多糖处理组。

3 讨 论

枸杞多糖(LBP)是枸杞子提取液的主要成分，而枸杞子是中医临床上常用的一种传统中药，具有滋补肝肾、益睛明目、润肺、延缓衰老、壮阳等多种功效，在中医男科上，应用较多。近年来的研究表明，LBP具有提高免疫、保护生殖系统、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗疲劳、抗衰老等作用，而其诸多功效与其抗氧化作用有关[4]。枸杞多糖在体外细胞水平能明显诱导人脐血间充质干细胞、大鼠骨髓间充质细胞向神经元样细胞分化，且与LBP的抗氧化应激功能明显相关[5-6]。另有大量实验证实LBP对中枢神经及视网膜神经等具有较好的神经保护作用[7-9]。在前期的动物实验中，我们也证实了枸杞多糖可促钳夹损伤后CN的再生，因此，我们预测氧化应激在此过程中起重要作用。

在本实验中，我们通过建立大鼠双侧CN钳夹损伤的模型，在应用LBP灌胃处理后，监测了不同时间段血清丙二醛含量、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性测定来反应机体的氧化应激水平的变化规律，术后3个月，通过测定最大海绵体内压的变化，反映其勃起功能的恢复情况，CN甲苯胺蓝染色来观察其神经损伤及修复情况。结果发现，在术后第1、2周和第4周，LBP组超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性明显高于其他两组；在第2周及第4周，LBP组丙二醛含量明显低于假手术组及钳夹损伤组；在术后12周，三组大鼠间血清丙二醛含量、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性差异均无统计学意义。但术后12周，损伤对照组ICP峰值的变化明显降低，且CN横切面轴突出现明显萎缩和减少，而LBP应用组ICP、CN有髓鞘轴突数目虽低于假手术组，但均显著高于损伤对照组。

由此可见，应用LBP可通过减轻CN钳夹损伤后早期的氧化应激水平来促进CN损伤后的神经再生和勃起功能的恢复。

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(编辑 王 玮)

The neuroprotective effect of lycium barbarum polysaccharide after cavernous nerve injury is mediated by antioxidative mechanism

DING Xie-gang1，LIU Bo1,2，LI Shi-wen1，Wang Xing-huan1

(1.DepartmentofUrology，ZhongnanHospital，WuhanUniversity，Wuhan430071; 2.DepartmentofUrology，TaiheHospital，HubeiUniversityofMedicine，Shiyan442000，China)

ObjectiveToinvestigatetheneuroprotectiveeffectoflyciumbarbarumpolysaccharides(LBP)mediatedbyantioxidativemechanismaftercavernousnerve(CN)injury.MethodsAtotalof84maleSDratswererandomlydividedintothreegroups：shamoperationgroup(shamgroup)，bilateralCNcrushedgroup(controlgroup)，bilateralCNcrushedwithanoraladministrationofLBP1dayafterCNinjuryfor2weeks(LBPgroup).Malondialdehyde(MDA)，superoxidedismutase(SOD)andglutathioneperoxidase(GPX)wereevaluatedinweek1，2，4，and12.Erectilefunctionwasassessedbycavernousnerveelectrostimulationinweek12andnerveregenerationwasassessedbytoluidinebluestainingofCN.ResultsSODandGPXactivitiesintheLBPgroupweresignificantlyhigherthanthoseintheshamandcontrolgroupinweek1，2and4.MDAlevelinLBPgroupwassignificantlylowerthanthatintheshamandcontrolgroupinweek2and4.Inweek12，themeanintracavernouspressure(ICP)，andthenumberofmyelinatedaxonsofCNsinLBPgroupweresignificantlyhigherthanthoseinthecontrolgroup，butlowerthanthoseintheshamgroup.ConclusionLBPcouldpromotenerveregenerationanderectilefunctionrecoveryafterCNcrushinjurybyreducingantioxidativereaction.

lyciumbarbarumpolysaccharide;erectiledysfunction;cavernousnerve

2015-07-30

2016-09-21

国家自然科学基金(No.81100492)

李世文，教授，主任医师，博士生导师.E-mail:drlishiwen@sina.com

丁协刚(1980-)，男，(汉族)，医学博士，主治医师.研究方向：泌尿外科及男科的基础与临床研究.E-mail:dxg1014@aliyun.com

R

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2016.12.016