新型循环肿瘤细胞计数与上皮/间质型探针标记技术在膀胱癌中的临床应用

张瑞赟，金 迪，曹 明，陈海戈，薛 蔚，黄翼然

(上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿科，上海 200127)

·临床研究·

新型循环肿瘤细胞计数与上皮/间质型探针标记技术在膀胱癌中的临床应用

张瑞赟，金 迪，曹 明，陈海戈，薛 蔚，黄翼然

(上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿科，上海 200127)

目的 本研究旨在探索在膀胱肿瘤中，新型循环肿瘤细胞(CTC)计数技术与基于RNA原位杂交的上皮/间质型探针标记技术的临床应用价值，初步探索上皮-间质转化在循环肿瘤细胞的作用与膀胱肿瘤肌层浸润的关系。方法 本研究纳入2015年5月至10月我院诊治的膀胱癌患者(cT1～4aN0M0)115名，同时纳入25名健康志愿者作为对照组。采用改良的CanPatrolTM法分离富集CTC，应用上皮型(Epi)探针(EpCAM、CK8/18/19)和间质型(Mes)探针(Twist、Vimentin)通过RNA原位杂交(RNA-ISH)对分离得到的CTC细胞进行EMT标记。结果 115名膀胱癌患者中93例(81%)患者为CTC阳性，健康志愿者共检测到CTC 0个(P<0.001)。对CTC进行RNA-ISH，发现肌层浸润型膀胱癌患者外周血CTC(P=0.049)、混合型CTC(P=0.018)及间质型CTC(P<0.001)的检出阳性率显著高于非肌层浸润性膀胱癌。pT1患者外周血CTC(P<0.001)、上皮型CTC(P=0.001)与混合型CTC(P<0.001)显著高于pTa患者。结论 新型循环肿瘤细胞(CTC)计数与基于RNA原位杂交的上皮/间质型探针标记技术可较敏感的检测出膀胱癌患者循环肿瘤细胞。间质表型CTC可能与肿瘤肌层浸润相关，提示EMT与膀胱肿瘤肌层浸润可能存在相关性。

膀胱癌；循环肿瘤细胞；上皮间质转化；肿瘤浸润； RNA原位杂交

膀胱癌(bladder carcinoma，BC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，位居世界范围内恶性肿瘤发病率第五位，每年全球新发病例约336 000例，死亡132 000例[1]。在我国，男性膀胱癌发病率位于全国恶性肿瘤的第七位且发病率逐年上升。70%的患者在初诊时为非肌层浸润性膀胱癌(nonmuscle invasive bladder cancer，NMIBC)，预后较好，但30%的患者为肌层浸润性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer，MIBC)，50%肌层浸润性膀胱癌的接受根治手术前既已发生微转移灶，即使接受积极治疗亦不可避免地在2年内发生远处转移[2]。

研究表明实体瘤在最初的转移进程中，肿瘤细胞从原发病灶脱落，突破一系列屏障，进而趋化性移动进入淋巴管和血液循环形成循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)[3]。CTCs从原发病灶或转移病灶脱落进入血液循环的过程中，由于血液中机械剪切力、免疫监视或其他监管机制的作用，大部分肿瘤细胞会发生凋亡或被吞噬，有极小部分肿瘤细胞在血液循环中能够抵御凋亡存活下来，形成微小转移病灶，进一步发展成为临床转移灶[4-5]。肿瘤细胞脱落、侵袭并进入血液循环可能是肿瘤转移的最初阶段[4]。有研究表明对于转移性膀胱癌，CTC阳性的患者预后差于CTC阴性的患者，而对于局部进展期膀胱癌，根治手术前CTC阳性的患者预后要差于阴性的患者，但与肿瘤分期的关系仍然不明确[6-7]。

近期的研究表明，上皮间质转化过程(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在CTCs侵袭中具有重要作用：CTCs具有上皮细胞表型、间质细胞表型和上皮-间质混合细胞表型以及循环微小瘤栓(Circulating tumor microemoli，CTM)等不同类型，其中间质型CTCs能够抵御失巢凋亡和耐受细胞毒性药物，比单个肿瘤细胞具有更强的侵袭转移潜能和耐药能力[4,7-9]。本研究基于应用CanPatrolTM，在CTCs计数技术上应用RNA原位杂交的上皮/间质型探针标记技术，探索上皮-间质转化在循环肿瘤细胞细胞中的作用与膀胱肿瘤肌层浸润的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本研究纳入标准：初发高危膀胱肿瘤，临床分期为cT1～4aN0M0，病理类型为尿路上皮癌。排除标准为：复发的膀胱肿瘤，临床分期为cTa，影像学显示肿瘤临近脏器侵犯、淋巴结转移或远处转移，有TURBT术或根治性全膀胱切除术禁忌证，病理类型为非尿路上皮癌，合并其他恶性肿瘤。

研究纳入2015年5月至2015年10月在我院诊治的115例膀胱肿瘤患者，在行首次TURBT术前采10 mL外周血。研究同时纳入25例健康志愿者作为对照组。

1.2 CTCs检测 膀胱肿瘤患者在TURBT术前使用EDTA抗凝采血管采集10 mL外周血。对照组健康志愿者使用相同EDTA抗凝采血管采集10 mL外周血。血样在4 h内进行按改良的CanPatrolTM进行预处理[9]。CTC细胞分离采用改良的CanPatrolTM分离技术，技术细节如CanPatrolTM报道文献，严格按照产品说明书操作[9]。通过8 μm直径纳米膜筛孔过滤后，获得分离的CTC细胞。针对分离所得CTC细胞，使用多重RNA-原位杂交技术进行标记鉴定。使用的特异性捕获探针包括上皮型探针(EpCAM，CK8/18/19)、间质型探针(Twist,Vimentin)与CD45。多重RNA-原位杂交具体流程为：①使用特异性捕获探针与目标mRNA进行杂交；②使用扩增探针与捕获探针进行杂交，为杂交信号的放大做准备；③使用标记有荧光基团的标记探针与扩增探针进行杂交，产生荧光信号；④利用自动识别系统阅读荧光。所使用探针序列与材料为CanPatrolTM技术标准方案，细节如文献[9]所示。CD45阳性细胞考虑为血细胞，不计入CTC。上皮型探针阳性间质型探针阴性CTC为上皮型CTC，上皮型探针阳性间质型探针阳性性CTC为混合型CTC，上皮型探针阴性间质型探针阳性性CTC为间质型CTC，如图1所示。

1.3 统计学方法 本研究采用SPSS®21.0(IBM Corp，NY，USA)软件进行统计学分析。分类变量通过Fisher’sexacttest与Pearson’schi-squaredtest进行检验。连续变量通过Mann-WhitneyU-test进行检验。P<0.05差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床病理结果 115例患者均顺利完成CTC检测及TURBT术，基本情况如表1所示。其中46例患者接受保留膀胱治疗，69例患者TUR术后接受即刻根治性全膀胱切除术。术后病理根据WHO2004年分级标准，低级别尿路上皮癌6例(5%)，高级别尿路上皮癌109例(95%)。根据肿瘤是否侵犯膀胱肌层分类，NMIBC 62例(54%)，MIBC 53例(46%)。根据2009年UICC膀胱癌TNM分期标准，pTa 17例(15%)，pT1 37例(32%)，pTis 8例(7%)，pT2 29例(25%)，pT3 20例(17%)，pT4 4例(3%)，pN1 9例(8%)，病理合并脉管癌栓9例(8%)。

2.2 CTCs检测结果 对照组25例健康志愿者外周血皆未检测到CTC。115例患者10 mL外周血中检测CTC，93例(81%)患者CTC阳性，其中68例(59%)上皮型CTC阳性，76例(66%)混合型CTC阳性，43例(37%)间质性CTC阳性。共检测到622个CTC，中位数为6个(范围：1～66个)，平均数为(5.56±8.17)个，其中上皮型173个(28%)，混合型322个(52%)，间质型127个(20%)。

2.3 CTCs与病理分期相关 对照组、NMIBC、MIBC患者CTC阳性率与数量如图2所示。NMIBC与MIBC患者体内CTC阳性率与数量显著高于对照组(P<0.001)。NMIBC患者外周血中，46例(74%)CTC阳性，32例(52%)上皮型CTC阳性，35例(56%)混合型CTC阳性，14例(23%)间质性CTC阳性。MIBC患者外周血中，47例(89%)CTC阳性，36例(68%)上皮型CTC阳性，41例(77%)混合型CTC阳性，29例(55%)间质性CTC阳性。MIBC患者外周血总CTC(P=0.049)、混合型CTC(P=0.018)与间质性CTC(P<0.001)阳性率较NMIBC患者显著升高，上皮型CTC未见显著差异(P=0.076)。MIBC患者外周血总CTC数量(P<0.001)、混合型CTC数量(P<0.001)与间质性CTC数量(P=0.002)较非肌层浸润性膀胱癌显著升高，上皮型CTC数量未见显著差异(P=0.075)。

不同病理状态与特征的CTC检测阳性率如图3 所示。对于NMIBC，pT1患者外周血CTC(P<0.001)、上皮型CTC(P=0.001)与混合型CTC(P<0.001)阳性率较pTa患者显著升高，间质性CTC(P=0.211)未见显著差异。对于MIBC，不同病理分期(pT2、pT3、pT4)的CTC阳性率与各亚型CTC阳性率未见显著差异。

病理证实肿瘤侵犯脉管系统(LVI+)的患者与未侵犯(LVI-)的患者CTC阳性率与各亚型CTC阳性率未见显著差异。在接受根治性全膀胱切除术患者中，术后病理证实肿瘤淋巴结转移(pN+)与无淋巴结转移(pN-)患者，CTC阳性率与各亚型CTC阳性率未见显著差异。

表1 患者临床资料

图1 不同EMT分型CTC镜下照片

DAPI：4′,6-diamidino-2-phenylindole；E：上皮RNA探针EpCAM，CK8/18/19；M：间质RNA探针Twist、Vimentin；Merge：融合照。

图2 对照组(健康志愿者)、非肌层浸润性膀胱癌(pT<2)、肌层浸润性膀胱癌(pT≥2)的外周血CTC阳性率与数量

A：肌层浸润性膀胱癌患者外周血总CTC(P=0.049)、混合型CTC(P=0.018)与间质性CTC(P<0.001)阳性率较非肌层浸润性膀胱癌显著升高，上皮型CTC未见显著差异(P=0.076)；B、C、D、E：肌层浸润性膀胱癌患者外周血总CTC(P<0.001)、混合型CTC(P<0.001)与间质性CTC(P=0.002)数量较非肌层浸润性膀胱癌显著升高，上皮型CTC数量未见显著差异(P=0.075)。

图3 不同病理参数与其CTC阳性率比较

A：非肌层浸润性膀胱癌中，固有层浸润患者(pT1)外周血CTC(P<0.001)、上皮型CTC(P=0.001)与混合型CTC(P<0.001)阳性率较肿瘤局限黏膜层患者(pTa)显著升高，间质性CTC(P=0.211)未见显著差异；B：肌层浸润性膀胱癌中，不同病理分期(pT2、pT3、pT4)CTC阳性率未见显著差异；C：脉管系统侵犯(LVI+)患者与未侵犯(LVI-)患者CTC阳性率未见显著差异；D：接受根治性全膀胱切除患者，术后病理证实肿瘤淋巴结转移(pN+)与无淋巴结转移(pN-)患者，CTC阳性率未见显著差异。

3 讨 论

约50%的肌层浸润性膀胱癌在术前即发生微转移，利用精准检测技术提前预判微转移灶，为临床干预提供指导是目前研究的热点[3]。CTC检测技术被广泛应用于各种实体瘤的诊断、治疗监测及转移预测中。然而在膀胱癌中，有关CTC的研究较少，应用较局限，结论仍有争议。MSAOUEL和KOUTSILIERIS[10]对于膀胱癌中CTC的研究进行荟萃分析，发现膀胱癌患者外周血可以较敏感的检测到CTC，而晚期膀癌患者体内可检出CTC数量显著较高。目前对于膀胱癌中CTC的研究主要局限于应用CellSearch®系统。在NMIBC中，GAZZANIGA等[11]报道了对44例NMIBC进行外周血CTC检测，结果发现CTC阳性的患者术后复发间隔时间显著较短，且与病理混合原位癌及较高T分期相关。GRADILONE等[12]发现对于T1G3的膀胱肿瘤，外周血所检测到的CTC多表达Survivin，且CTC阳性的患者无疾病生存期显著较短。对于非转移性MIBC，RINK等[13]研究表明在全膀胱术前CTC阳性的患者预后显著较差，然而CTC数量与病理分期无显著相关。FLAIG等[6]研究证明对于转移性膀胱癌，CTC阳性的患者预后显著较差，而对于局限性MIBC，CTC与预后及病理分期无显著关联。以上研究都旨在探索CTC对于膀胱癌的分期与预后的指导作用，然而收到样本量、队列设计等限制，未证明肿瘤肌层浸润与CTC的相关性。

在膀胱肿瘤中，EMT被认为是肿瘤转移重要的环节[4-6]。如何通过评价CTC的EMT表型成为了目前研究的热点。TODENHÖFER等[15]通过对CTC分离并提取mRNA逆转录cDNA，并通过PCR检测cDNA中EMT相关基因(PI3Kα、Twist1和AKT2)发现，EMT相关基因表达与临床分期相关，且常表达于上皮类标记物阴性患者。此结果提示在CTC中，EMT相关基因有表达，且表达具有一定特征性，为后续在CTC单细胞水平进行EMT表达检测提供了基础。

本研究立足于改良的CanPatrolTM技术，将上皮间质转化(EMT)通路相关基因RNA探针整合入CTC检测中，在前期其他实体瘤检测中取得了良好的效果[9,16]。本研究首次在膀胱肿瘤患者外周血内检测分离CTC，并在CTC单细胞水平进行EMT相关基因表达进行检测。研究结果发现通过CanPatrolTM法分离并进行EMT分型可较敏感的分离出膀胱肿瘤患者外周血内的CTC细胞。对照组健康志愿者无一例检出CTC，符合实验预期，无假阳性结果。

本研究旨在探讨外周血CTC与EMT表型对于膀胱肿瘤分期，尤其是肿瘤肌层浸润的相关性与指导作用。因此本研究队列纳入临床诊断为高危的膀胱肿瘤，临床分期cT1～4aN0M0。115例患者术后病理为pTa～4aN0～1M0，95%为高级别尿路上皮癌，符合实验队列设计预期。所有患者CTC检测的总阳性率为81%，高于其他研究报道，可能的原因为CellSearch®系统利用上皮标记物EpCAM作为CTC标记物，导致一部分高表达间质标记物而低或无表达EpCAM的CTC细胞将不被CellSearch®系统识别，而CanPatrolTM系统可将此类CTC细胞标记识别，并引起CTC检测阳性率升高。YU等[5]在乳腺癌中报道了CTC存在EMT动态变化的现象，并发现存在部分CTC细胞仅表达间质相关基因，证明了仅将上皮标记物EpCAM阳性作为CTC的筛选标记物是不足的。TODENHÖFER等[15]的研究结果揭示了存在一部分高表达PI3Kα、TWIST1和AKT2的CTC细胞，且这部分细胞常低或无表达上皮标记物，佐证了我们的观点。

对CTC进行EMT分型后，上皮型CTC阳性率为59%，混合型CTC阳性率为66%，与通过CellSearch®系统检测的结果相接近。在检测出的622个CTC细胞中，上皮标记物阳性(上皮型和混合型)的CTC占80%。结果表明在CTC中，大多数细胞呈上皮表型或表达上皮相关基因，结果符合肿瘤转移EMT理论[5-6]。37%的患者间质性CTC阳性，间质型CTC占所有检出CTC的20%，结果证明了在膀胱肿瘤患者外周血中，存在其他研究中报道的仅表达间质标记物的CTC细胞。

根据最终病理结果中肿瘤是否侵犯肌层，研究队列中54%为NMIBC，46%为MIBC。结果提示MIBC外周血CTC阳性率与数量显著高于NMIBC，其中间质标记物阳性(混合型与间质型)CTC阳性率与数量较NMIBC患者显著升高，结果提示对于高病理分期的肿瘤，其CTC在EMT表型上也有不同。有文献报导，在乳腺癌、胃癌等其他实体肿瘤中，间质表达阳性的CTC与肿瘤高分期、预后较差相关。在膀胱肿瘤中，EMT通路的激活与肿瘤细胞发生上皮间质转化与肿瘤浸润肌层密切相关。在临床上，MIBC的预后显著较NMIBC差，MIBC的患者常发生远处转移，而90%的NMIBC的患者不会发生远处转移。本研究结果在CTC层面验证了膀胱肿瘤浸润肌层后，其微转移病灶阳性比率与数量显著升高，为后续研究提供了方向。

本研究结果表明对于NMIBC的患者，pT1期患者外周血CTC与上皮标记物阳性(上皮型与混合型)CTC检出阳性率显著高于pTa期患者。pT1期膀胱癌有10%～20%会复发、进展为浸润性癌，此类患者易发生远处转移，而pTa期患者进展率较低，极少发生远处转移，研究结果在CTC层面解释了不同分期的预后差别。而对于MIBC患者，研究未发现不同病理分期的CTC阳性率差异，可能的原因为：对于MIBC患者，CTC阳性率较高，在样本量限制条件下，难以获得统计学上显著差异。

对于病理发现淋巴结转移及肿瘤侵犯脉管的患者，本研究未发现CTC阳性率升高，其可能的原因为：肿瘤淋巴结转移机制与血性转移机制不同，无法应用CTC来评估淋巴结转移情况。

本研究通过对于较大样本的CTC检测与EMT分型，验证了通过CanPatrolTM系统可较敏感的检测出膀胱癌患者循环肿瘤细胞。CTC细胞数量与表达间质型表型RNA阳性的细胞数量可能与肿瘤肌层浸润相关，提示EMT与膀胱肿瘤肌层浸润可能存在相关性。本研究仅为单中心回顾性研究，循证证据级别有限，且因随访时间限制未获得生存相关数据。但我们认为研究结果为进一步探索CTC单细胞层面EMT表型与膀胱肿瘤预后，以及研究肿瘤浸润转移机制奠定了基础，有重要的临床与研究意义。研究组已开展前瞻性研究，针对患者预后判断、治疗监测等进行进一步研究。

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(编辑 王 玮)

Novelcirculating tumor cells enumeration and epithelial/mesenchymal probe marking technique in the treatment of bladder cancer

ZHANG Rui-yun，JIN Di，CAO Ming，CHEN Hai-ge，XUE Wei，HUANG Yi-ran

(Department of Urology，Renji Hospital,School of Medicine,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200127，China)

Objective To explore the diagnostic use of novel circulating tumor cells (CTCs) enumeration and epithelial/mesenchymal probe marking technique in bladder urothelial cancer (BCa)，and to analyze the correlation between CTCs and pathological outcomes.Methods A total of 115 patients with primary diagnosed bladder carcinoma (cT1～4aN0M0) treated during May 2015 and Oct. 2015 were included，and another 25 healthy volunteers served as controls. CTCs were separated with modified CanPatrolTMSystem. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) was performed with epithelial tumor cells (Epi+) specific probes (EpCAM，CK8/18/19) and mesenchymal tumor cells (Mes+) specific probe (Twist，Vimentin) on isolated CTCs.Results CTCs were positive in 93 patients (81%) with BCa，while all negative (0%，0) in healthy controls (P<0.001). In RNA-ISH assay，we observed that patients with muscle invasive bladder cancer had significantly higher positive rates of CTCs (P=0.049)，Epi+Mes+ CTCs (P=0.018) and Epi-Mes+ CTCs (P<0.001) compared with non-muscle invasive bladder cancer. Further analysis showed that the pT1 patients had significantly higher positive rate of CTCs (P<0.001)，Epi+Mes-CTCs (P=0.001) and Epi+Mes+ CTCs (P<0.001) than pTa patients.Conclusion The novel CTCs enumeration and RNA-ISH based epithelial/mesenchymal probe marking technique could be a sensitive detection method for patients with bladder cancer. The increase of Mes+CTCs might be associated with muscle invasion，which suggested EMT could be related with invasion and metastasis in muscle invasive bladder cancer.

bladder cancer; circulating tumor cell; epithelial mesenchymal transition; tumor invasion; RNA-ISH

2016-09-18

2016-10-18

上海市自然科学基金(No.16ZR1420300)，国家自然科学基金(No.81402084，81472378，81272841)

黄翼然，教授.E-mail：hyrrenji2@aliyun.com

张瑞赟(1990-)，男(汉族)，博士在读.研究方向为泌尿系肿瘤.E-mail：zhangruiyun4337@163.com

R737

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2016.12.003