气相色谱-串联质谱法测定乌龙茶中5种氨基甲酸酯类农药

余宇成，方 灵，苏德森*，林 虬，傅建炜，罗 超

(1.福建省农业科学研究院 农药质量标准与检测技术研究所 福建省精密仪器农业测试重点实验室，福建福州 350001；2.福建省食品药品质量检验研究院，福建 福州 350005)



气相色谱-串联质谱法测定乌龙茶中5种氨基甲酸酯类农药

余宇成1，方 灵1，苏德森1*，林 虬1，傅建炜1，罗 超2

(1.福建省农业科学研究院 农药质量标准与检测技术研究所 福建省精密仪器农业测试重点实验室，福建福州 350001；2.福建省食品药品质量检验研究院，福建 福州 350005)

建立了乌龙茶中5种氨基甲酸酯农药(速灭威、异丙威、仲丁威、残杀威和抗蚜威)同时测定的气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)分析方法。样品经正己烷-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液提取后，通过400 mg PSA/400 mg C18/1 200 mg MgSO4的QuEChERS试剂盒进行净化，Rxi-5 Sil MS毛细管柱(30 m，0.25 mm×0.25 μm)进行分离，串联质谱进行定性定量分析。5种农药在各自的线性范围(速灭威和残杀威为5～500 μg/kg，异丙威、仲丁威和抗蚜威为1～500 μg/kg)内具有良好的线性关系，相关系数(r2)均大于0.99；在5，20，100 μg/kg 3个加标水平下，速灭威和残杀威的平均回收率为77.5%～95.4%，相对标准偏差(RSD，n=6)为2.1%～6.1%，检出限和定量下限分别为1 μg/kg和5 μg/kg；在1，20，100 μg/kg 3个加标水平下，异丙威、仲丁威和抗蚜威的平均回收率为79.5%～102.5%，RSD为2.0%～8.2%，检出限和定量下限分别为0.2 μg/kg和1 μg/kg。该方法操作简单、灵敏度高、重现性好，可满足乌龙茶样品中5种氨基甲酸酯类农药残留的分析要求。

乌龙茶；QuEChERS；氨基甲酸酯农药；气相色谱-串联质谱

氨基甲酸酯农药是一类广谱杀虫剂，是以甲酸酯为前体化合物发展而来的，由于其具有药效快、杀虫谱广、易代谢、高效、选择性强等优势[1]，在农业生产过程中得到广泛使用。但氨基甲酸酯类农药属于胆碱酯酶抑制剂，可以抑制人体内的乙酰碱酯酶，使体内的酶活性下降而引起中毒，如灭多威可引起头昏、头痛和视力模糊等不良反应，严重时危害神经系统；涕灭威亚砜和涕灭威砜可能对小牛胸腺DNA造成加合作用[2-5],对人体健康造成严重危害，同时，该农药残留对环境也产生越来越大的影响。因此，世界各国及组织先后制定了多种氨基甲酸醋类农药的最高残留限量(MRL)[6-9]，限量标准日益严格。乌龙茶作为我国产量较大的茶叶品种之一，其在种植过程中农药滥用导致的农药残留问题已经成为影响我国乌龙茶出口的重要原因之一，形成的贸易壁垒严重阻碍了我国乌龙茶产业的发展。因而控制茶叶农药残留量，保证其品质显得越来越重要。

目前，对氨基甲酸酯类农药残留分析主要采用气相色谱法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法和气相色谱-串联质谱法[10-15]。但气相色谱法对于氨基甲酸酯类农药的灵敏度较低；液相色谱法检测氨基甲酸酯类农药时，需进行衍生，操作复杂，衍生试剂昂贵，易发生衍生不完全的现象；而液相色谱-串联质谱的检测成本相对较高，且操作较为繁琐。因此，探索一种前处理简便、灵敏度高的检测方法迫在眉睫。本研究选取福建特色茶种乌龙茶作为研究对象，考察了仲丁威、异丙威、抗蚜威、速灭威、残杀威5种氨基甲酸酯类农药残留特性，建立了气相色谱-串联质谱检测乌龙茶中5种氨基甲酸酯农药残留的分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Shimadzu GC-MS TQ8040气相色谱-串联质谱仪(日本岛津公司)；涡旋振荡器(德国IKA公司)；HGC-36A氮吹仪(天津恒奥有限公司)；KQ-500DE超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；Anke TDL-5-A离心机(上海安亭科学仪器厂)；AL 204电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

色谱纯的丙酮、正己烷、乙酸乙酯，QuEChERS试剂盒(400 mg PSA/400 mg C18/1 200 mg MgSO4)均购自中国Dikma公司；仲丁威、异丙威、抗蚜威、速灭威、残杀威5种标准物质均购自Dr.Ehrenstorfer公司(德国)，纯度均≥98%。

氨基甲酸酯标准溶液的配制：称取5种氨基甲酸酯标准物质各0.01 g，用丙酮溶解定容至10 mL，配成1 mg/mL的标准储备液；准确量取5种氨基甲酸酯标准储备液各0.1 mL至同一10 mL容量瓶中，丙酮定容并混匀，配成10 μg/mL的混合标准工作液。

1.2 样品前处理

准确称取1 g 乌龙茶样品至50 mL 聚丙烯离心管中，加入10 mL正己烷-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液，旋涡振荡后超声30 min，5 000 r/min 离心5 min，取上清液，待净化。

将提取液加入盛有400 mg PSA/400 mg C18/1 200 mg MgSO4的QuEChERS试剂盒中(试剂盒为15 mL离心管)，旋涡振荡10 min，使吸附剂与提取液充分接触；振荡后以5 000 r/min离心5 min，将上清液转移至一洁净试管中，氮吹至干，丙酮定容至1 mL，供 GC-MS/MS分析。

1.3 色谱-质谱条件

气相色谱条件：色谱柱为Rxi-5 Sil MS(30 m，0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度250 ℃；柱温：柱温箱初始温度为50 ℃，以20 ℃/min升至180 ℃，再以5 ℃/min升至280 ℃，保持5 min；进样方式：不分流进样；进样量：1 μL；载气：高纯氦气(99.999%)，恒定流速：1 mL/min。

质谱条件：电子轰击离子源(EI源)；离子源电压：70 eV；离子源温度：200 ℃；接口温度：250 ℃；溶剂延迟4 min；5种待测组分的保留时间、母离子、特征离子碎片、碰撞电压及驻留时间信息见表1。

表1 5种氨基甲酸酯农药的质谱信息

* quantitative ion pairs

2 结果与讨论

2.1 GC-MS/MS方法的建立

茶叶是当前分析测试领域公认的成分复杂的基质之一，含有大量易挥发性物质和色素，即使通过一定手段进行净化，在分析时仍存在较大干扰，使用气相色谱或单级质谱分析定量均有一定难度，因此本研究采用选择性高、抗干扰能力强及灵敏度高的串联质谱进行分析，并对5种氨基甲酸酯农药的色谱条件和质谱条件进行了优化。

实验首先通过单一标准物质全扫描，确定各组分的保留时间(见表1)。结果发现，除仲丁威和残杀威的保留时间相近外，其他3种农药均有很好的分离。而通过改变升温程序仍不能较好的分离仲丁威和残杀威，但同一时间出峰的化合物可通过多反应监测(MRM)中离子对的响应进行区分，对样品中的农药残留含量测定无影响，因此本研究对其分离未做进一步优化。确定保留时间后，通过全扫描数据确定各组分的前体离子信息，确定相对丰度较大、高质量的，且能产生较强响应的碎片离子作为前体离子；再通过Smart Database MRM优化工具确定各组分的碎片离子信息及最优的碰撞电压(表1)，从而建立了乌龙茶中5种氨基甲酸酯类农药的GC-MS/MS检测方法。5种氨基甲酸酯农药的总离子流图见图1A。

图1 5种氨基甲酸酯农药标准溶液(A)及空白样品加标(0.05 μg/mL,B)的总离子流色谱图

图2 不同提取溶剂条件下5种农药的平均提取效率Fig.2 Average extraction efficiencies of 5 carbamate pesticides under the conditions of different extraction solvents the number denoted was the same as that in Fig.1

2.2 前处理方法的优化

目前常用于农药残留提取的溶剂主要有乙腈、正己烷、乙酸乙酯、丙酮及其混合溶液，乙腈的饱和蒸汽压低，挥发性较低；丙酮和乙酸乙酯属中等极性，提取能力更强。本研究比较了乙腈、乙腈-丙酮(1∶1)、正己烷及正己烷-乙酸乙酯(1∶1) 4种不同提取溶剂的提取效率(图2)。结果显示，正己烷的提取效率最差，而常用的乙腈及其与丙酮混合溶剂的提取效率也偏低，其原因可能是茶叶基质较为复杂，乙腈及乙腈-丙酮混合溶液的共提取物较多，产生了较强的基质效应，从而对目标化合物的响应产生了抑制，而采用正己烷-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液提取时，5种农药的平均回收率最高。因此本研究选用正己烷-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液对乌龙茶中5种氨基甲酸酯类农药进行提取。

2.3 净化方法的优化

乌龙茶中主要含有氨基酸、多元酚类、咖啡因、植物色素、有机酸等大量干扰成分，这些挥发性成分在气相色谱测定时对目标组分的定量具有很大影响，因此需对样品进行净化，以尽可能除去基质干扰成分。目前，对于样品中氨基甲酸酯类农药测定的净化方法主要为固相萃取(SPE)法，该方法虽能有效除去杂质，但操作复杂、耗时、耗溶剂。QuEChERS净化方法主要用于农药残留分析，该净化方法具有快速、操作简便、高效等特点，并且样品损失大幅减少，回收率更高。其使用的PSA，C18和GCB吸附剂对碳水化合物、脂肪酸、脂类、有机酸以及色素具有很好的吸附效果。因此本研究采用QuEChERS净化方法，选用成本低的QuEChERS试剂盒(400 mg PSA/400 mg C18/1 200 mg MgSO4)对样品进行净化，并比较了相同条件下SPE固相萃取法和QuEChERS方法对乌龙茶样品的净化效果。结果显示，5种农药在QuEChERS净化方法下，平均回收率均高于SPE法。其原因可能是固相萃取柱在使用时由于茶叶样品杂质较多，易导致柱体堵塞，目标物未能完全洗脱；或样品与固相萃取填料接触时间不够，未完全净化，导致净化后样品基质效应仍明显。空白样品经QuEChERS法净化后，5种氨基甲酸酯类农药加标的总离子流图如图1B所示，可以看出，样品经净化后，在目标物出峰处无干扰，能够较好的进行定量分析。

2.4 线性范围与灵敏度

取不含该5种氨基甲酸酯农药残留的空白乌龙茶样品，通过本研究的前处理方法提取净化后，用该空白样品提取液稀释标准储备液配制成系列浓度的基质匹配标准工作液，采用“1.3”色谱及质谱条件分析后，以各目标组分的浓度(X，μg/kg)与对应的响应峰面积(Y)绘制基质匹配标准曲线，根据S/N≥3(信噪比)和S/N≥10分别确定方法检出限(LOD)和定量下限(LOQ)，结果见表2。从表2可以看出，速灭威和残杀威在5～500 μg/kg，其余3种农药在1～500 μg/kg范围内具有良好的线性关系，相关系数(r2)均大于0.99；5种氨基甲酸酯农药的LOD和LOQ分别为0.2～1.0 μg/kg和1.0～5.0 μg/kg，方法的灵敏度满足痕量分析的要求。

表2 5种氨基甲酸酯农药的线性方程、相关系数、检出限及定量下限

2.5 方法的回收率与精密度

向空白乌龙茶样品中添加不同浓度的5种氨基甲酸酯农药标准，添加水平参照GB/T 27404-2008 实验室质量控制规范要求，按照优化方法进行实验，每个浓度做6个平行，并做空白对照，计算加标回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表3。从表3可以看出，在5，20，100 μg/kg 3个加标水平下，速灭威和残杀威的平均回收率为77.5%～95.4%，RSD为2.1%～6.1%；在1，20，100 μg/kg 3个加标水平下，异丙威、仲丁威和抗蚜威的平均回收率为79.5%～102.5%，RSD为2.0%～8.2%，方法的准确度及精密度满足农药残留分析的要求，可应用于乌龙茶中5种氨基甲酸酯农药残留的检测分析。

表3 5种氨基甲酸酯农药的加标回收率及相对标准偏差(n=6)

3 结 论

本文建立了乌龙茶中速灭威、异丙威、仲丁威、残杀威和抗蚜威同时测定的气相色谱-串联质谱的定性定量方法。采用改进的QuEChERS方法进行前处理，正己烷-乙酸乙酯混合溶液(1∶1)提取后，通过400 mg PSA/400 mg C18/1 200 mg MgSO4的QuEChERS试剂盒进行净化，可有效去除有机酸、脂肪酸、甾醇、色素等杂质。采用GC-MS/MS动态多反应监测模式进行分析，5种氨基甲酸酯农药在各自线性范围内相关性良好，检出限和定量下限均满足痕量残留分析的要求。本方法前处理简单，耗时少、成本低，能较好地排除乌龙茶基质的干扰，可用于乌龙茶样品中氨基甲酸酯类农药残留的简便、快速、准确检测。

[1] Wang L Z，Huang X Y，Chen Y，Lin Z X，Wang G F，Zhou Y.J.Instrum.Anal.(王连珠，黄小燕，陈泳，林子旭，王根芳，周昱.分析测试学报)，2014,33(10):1102-1108.

[2] Sui H X，Liu Z P，Zhang L.Chin.J.Prevent.Med.(隋海霞，刘兆平，张磊.中华预防医学杂志)，2013,47(6):569-572.

[3] Lou Z H，Kong X S.Pract.Prevent.Med.(娄振华，孔祥松.实用预防医学)，2005,12(1):65-66.

[4] Xu M Y，Wang H P，Liang Y J，Zhu L，Wu Y J.Chin.J.Pharmacol.:Toxicol.(许明圆，王会平，梁宇杰，朱丽，伍一军.中国药理学与毒理学杂志)，2013,(S1):284.

[5] Song Y，Zhu L S，Wang J，Xie H，Liu W，Wang X Q，Wang Q，Qian B.AsianJ.Ecotoxicol.(宋艳，朱鲁生，王军，谢慧，刘伟，王秀国，王倩，钱博.生态毒理学报)，2006,1(1):40-44.

[6] Li R，Chu D K，Zhang P J，Gao Y Q，Huang S Y.J.Instrum.Anal.(李蓉，储大可，张朋杰，高永清，黄思允.分析测试学报)，2015,34(5):502-511.

[7] Li C Y，Bai Y Z，Niu S Z，Wang A，Yang T，Yu Z Q.J.Anal.Sci.(李崇瑛，白亚之，钮松召，王安，杨涛，余朝琦.分析科学学报)，2007,23(6):723-728.

[8] GB 2763-2014.National Food Safety Standard-Maximum Residue Limits for Pesticides in Food.National Standards of the People's Republic of China(食品中农药最大残留限量.中华人民共和国国家标准).

[9] Zsuzsa F，Andrew S，Thomas B W，Gabriella S，rpád A.J.Agric.FoodChem.，2015,63(18):4418-4428.

[10] Hao C Y，Nguyen B，Zhiao X M，Chen E，Yang P.J.AOACInt.，2010,2(93):400-410.

[11] He H L，Xu X M，Lü M L，Mo W M，Ren Y P.J.Instrum.Anal.(何华丽，徐小民，吕美玲，莫卫民，任一平.分析测试学报)，2014,33(2):197-202.

[12] Wan Y Q，Chen Z B.J.Anal.Sci.(万益群，陈宗保.分析科学学报)，2006,22(5):551-554.

[13] Jia W，Han Y H，Huang Z Z.J.Instrum.Anal.(贾薇，韩彦华，黄贞子.分析测试学报)，2001,20(1):260-261.[14] Su J F，Zhong M S，Chen J，Guo X，Chen J X，Liang Z，Liu J J.J.Instrum.Anal.(苏建峰，钟茂生，陈晶，郭昕，陈劲星，梁震，刘建军.分析测试学报)，2015,34(6):625-638.

[15] Liu S Y，Jin Q，Huang X H，Zhu G N.J.AOACInt.，2013,3(96):657-662.

Determination of Five Carbamate Pesticides Residues in Oolong Tea by Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

YU Yu-cheng1，FANG Ling1，SU De-sen1*，LIN Qiu1，FU Jian-wei1，LUO Chao2

(1.Key Laboratory of Precision Instrument and Agriculture of Fujian Province，Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology，Fujian Institute of Agricultural Sciences，Fuzhou 350001，China;2.Fujian Institute for Food and Drug Quality Control，Fuzhou 350005，China)

A gas chromatography-tandem mass spectrometric(GC-MS/MS) method was developed for the determination of 5 carbamate pesticides residues，i.e，metolcarb，isoprocarb，fenobucarb，propoxur and pirimicarb in Oolong tea samples.The sample was extracted with hexane-ethyl acetate mixed solution,and the extract was cleaned up with a QuEChERS kit，including 400 mg PSA/400 mg C18/1 200 mg MgSO4.The mixed targets were separated on a Rxi-5 Sil MS(30 m，0.25 mm×0.25 μm) capillary column,and pesticide residues were identified and quantified by GC-MS/MS.5 carbamate pesticides had good linear relationships in each linear range(5-500 μg/kg for metolcarb and propoxur，1-500 μg/kg for isoprocarb，fenobucarb and pirimicarb)，and the correlation coefficients were higher than 0.99.The mean recoveries of metolcarb and propoxur in black Oolong tea at spiked levels of 5，20，100 μg/kg were in the range of 77.5%-95.4%,with RSDs(n=6) of 2.1%-6.1%.The LODs and LOQs for the two targets were 1 μg/kg and 5 μg/kg，respectively.The mean recoveries of isoprocarb，fenobucarb and pirimicarb at spiked levels of 1，20，100 μg/kg were in the range of 79.5%-102.5%with RSDs(n=6) of 2.0%-8.2%.The LODs and LOQs were 0.2 μg/kg and 1 μg/kg，respectively.With the advantages of simple operation，high sensitivity and good reproducibility,this method could meet the requirements for the determination of 5 kinds of carbamate pesticides residues in Oolong tea samples.

Oolong tea;QuEChERS;carbamate pesticides;gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS)

2016-06-27；

2016-07-29

福建省属公益类科研院所基本科研专项(2014R1025-4,2015R1025-2,2016R1024-5)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.012

O657.63;F767.2

A

1004-4957(2016)12-1586-05

*通讯作者：苏德森，硕士，副研究员，研究方向：农产品质量安全与风险评估，Tel：0591-87869475，E-mail：7592763@qq.com