根结线虫提取液对番茄愈伤组织诱导的影响

孙亮亮，江春，张超，陈林晶，夏雨，张雅清

（1.晋中学院生命科学学院，山西晋中030600；2.山西农业大学农学院，山西太谷030801）

根结线虫提取液对番茄愈伤组织诱导的影响

孙亮亮1，2，江春1，张超1，陈林晶1，夏雨1，张雅清1

（1.晋中学院生命科学学院，山西晋中030600；2.山西农业大学农学院，山西太谷030801）

采用不同浓度的南方根结线虫浸泡培养液和研磨液配制成番茄培养基，以期加快番茄叶片愈伤组织的形成。结果表明，MS为较适的基础培养基，MS培养基中添加一定量的根结线虫提取液，番茄叶片愈伤组织诱导率明显提高；根结线虫浸泡液的较适浓度为A4，诱导率为85%；根结线虫研磨液的较适浓度为B3，诱导率为93%；根结线虫研磨液培养基优于根结线虫浸泡液培养基。

根结线虫；提取液；番茄叶片；愈伤组织

南方根结线虫（M.incognita）作为一种病原性农业土壤害虫，广泛分布于世界各地，是为害农业作物、林业植物最严重的病原生物之一[1]。

近年来，由于轮作无法实现土地休耕，导致蔬菜种植区土壤中虫口基数不断增多，蔬菜根结线虫为害日趋严重，严重影响到了蔬菜的产量和质量，一般致使蔬菜减产20%～50%[2]；而且根结线虫还加重了枯萎病、根腐病等土传性病害的发生，已成为当前蔬菜生产上的一大障碍[3-4]。根结线虫主要侵染植物根部，尤其侧根受害较多，其为害主要表现在2个方面：一方面，根结线虫口针刺激寄生部位细胞，产生巨型细胞或在植物根部形成根结，这些根结从形态上和生理功能上改变根系的正常疏导功能[5-6]；另一方面，根结线虫侵入造成的伤口易被其他病原物侵入，形成复合病害[7-8]。受害病株矮小，生长不良，结实少，干旱时中午萎蔫或提早枯死。到目前为止，国内对于番茄根结线虫在防治方面研究较多[9]，其包括农业防治、物理防治、化学防治、生物防治等[10-12]，但关于将根结线虫浸泡培养液和研磨液配制成植物培养基，以期加快植物叶片愈伤组织快速形成的研究尚无报道。植物组织培养是在离体条件下，在适合的培养基上诱导植物外植体，将有组织有结构的高度分化的植物体细胞经过脱分化，变为无特定组织结构的薄壁细胞团，并使细胞重新进入分裂状态[13]，从而形成愈伤组织。

本研究以加入根结线虫提取液和研磨液制成培养基培养番茄叶片诱导植物愈伤组织形成，以期找出较适浓度的根结线虫提取液培养基，为加快、加大诱导植物组培产生愈伤组织提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试番茄品种为阿佛拉。选择生长健壮、无病虫害的幼嫩番茄叶片作为材料。

供试根结线虫由晋中市榆次区下戈村温室棚土壤中分离。

1.2 方法

1.2.1 番茄叶片的处理先用软刷刷净番茄叶片表面附着物，然后在一定浓度的吐温20溶液中浸泡15 min；再将浸泡好的叶片放入小烧杯中，罩上纱布，流水下冲洗30 min左右。将冲洗好的叶片装进无菌三角瓶中，置于超净工作台上，首先加入75%酒精浸泡30 s，倒出酒精加入无菌水冲洗2～3次；其次加入0.1%HgCl2浸泡8 min，倒出HgCl2溶液加入无菌水冲洗3～5次；最后将无菌叶片切成0.5 cm×0.5 cm左右的小块，叶面朝上接种于准备好的培养基中，每瓶接4～6块叶片[14]。

1.2.2 根结线虫的处理

1.2.2.1 根结线虫的获取在体视解剖镜下解剖感病严重的番茄根部，并从中分离根结线虫卵囊，置于26℃无菌水中培养，孵化出2龄幼虫（图1）[15]。

1.2.2.2 根结线虫的处理室温条件下，分别将10，20，30，40，50条根结线虫在少量蒸馏水中培养24 h，后各自过滤取滤液，每份滤液加蒸馏水定容至50 mL，对应标记为A1，A2，A3，A4，A5，即为不同浓度的根结线虫浸泡液。

将10，20，30，40，50条根结线虫分别放入研钵中，加入石英砂研磨，用少量蒸馏水溶解研磨液，过滤取滤液，每份滤液定容至50 mL，对应标记为B1，B2，B3，B4，B5，即为不同浓度的根结线虫研磨液。

1.3 培养基

以MS为基础培养基[16]（基本培养基试验除外），添加不同浓度的根结线虫浸泡液或研磨液10 mL/L，蔗糖30 g/L，琼脂4.2 g/L，pH值调至5.8。

1.4 培养条件

培养温度为（22～26）℃，光照时数为12 h/d，光照强度为2 000 lx。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对番茄叶片愈伤组织诱导的影响

把处理好的番茄叶片接入表1所示的不同培养基中，观察统计愈伤组织的诱导率。

表1 不同培养基对番茄叶片愈伤组织诱导的影响

从表1可以看出，在培养基中不添加根结线虫提取液的情况下，番茄叶片愈伤组织诱导率普遍较低。并且，在培养过程中观察到，B5培养基的叶片只出现卷曲现象，不能诱发愈伤组织的形成，诱导率为0；MS和1/2 MS培养基都能诱导出愈伤组织，MS培养基诱导率高于1/2 MS。所以，番茄叶片诱导愈伤组织较适的基础培养基为MS（图2，3）。

2.2 不同浓度根结线虫浸泡液对番茄愈伤组织诱导的影响

由表2可知，MS培养基中添加不同浓度的根结线虫浸泡液，愈伤组织诱导率明显增大，且随着浸泡液浓度的增加，其诱导率逐步增大，当根结线虫浸泡液浓度为A4时，番茄叶片愈伤组织的诱导最大，为85%（图4）；但当浸泡液浓度继续增至A5时，其诱导率反而减小。

表2 不同浓度根结线虫浸泡液对番茄愈伤组织诱导的影响

2.3 不同浓度根结线虫研磨液对番茄愈伤组织诱导的影响

由表3可知，在添加根结线虫研磨液的MS培养基中，愈伤组织诱导率明显增大，但高浓度的根结线虫研磨液不利于番茄愈伤组织的诱导。随研磨液浓度增加，诱导率先增大后减小，当根结线虫研磨液浓度为B3时，番茄叶片愈伤组织诱导最大，为93%（图5）；当研磨液浓度增至B5时，诱导率最低。

表3 不同浓度根结线虫研磨液对番茄愈伤组织诱导的影响

3 讨论

本试验结果表明，根结线虫研磨液诱导率优于浸泡液，其原因可能是由于研磨液中含有浸泡液中所不含的某种可以促进番茄叶片愈伤化的物质，或者通过研磨线虫更能充分提取到具有诱导番茄叶片愈伤化的物质。但高浓度的研磨液诱导率明显减小，可能是由于根结线虫体内含有对植物有害的物质，或者是由于根结线虫研磨液对诱导番茄叶片愈伤化具有低浓度促进、高浓度抑制的作用效应，这还有待进一步研究。

愈伤组织具有高度的胚性或再分化能力、可获得再生植株及具有旺盛的自我增殖能力、经过长期继代保存而不丧失胚性等的优良特性[17]，在适宜培养基培养下，愈伤组织上会分化出芽点并陆续分化形成具有生长点的不定芽[18]。本试验在添加根结线虫提取液的培养基中培养出愈伤组织，进一步证实根结线虫提取液对愈伤组织的形成有明显促进作用。

4 结论

本试验表明，MS为较适基础培养基，在MS培养基中添加根结线虫提取液，番茄叶片愈伤组织诱导率明显增大。其中，根结线虫浸泡液的较适浓度为A4，诱导率达85%；根结线虫研磨液的较适浓度为B3，诱导率达93%，根结线虫研磨液培养基优于根结线虫浸泡液培养基。所以，番茄叶片愈伤组织诱导的较适根结线虫培养基为根结线虫研磨液B3。

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Influence of Extract of Root-knot Nematodes on Tomato Callus Induction

SUNLiangliang1，2，JIANGChun1，ZHANGChao1，CHENLinjing1，XIAYu1，ZHANGYaqing1
（1.College ofLife Sciences，JinzhongUniversity，Jinzhong030600，China；2.College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Tomato culture medium was prepared by different concentrations of two kinds of root-knot nematodes'extract（grinding extract and soaking extract）,and to accelerate formation of tomato-leaf callus.The results showed that MS was the better medium.The medium which mixed with a certain amount of root-knot nematodes'extract could improve the probability of inducing tomato-leaf to callus.The better root-knot nematodes'soaking and grinding extract density of medium were A4 and B3,and their inductivities were 85%and 93%,respectively.And the mediumwith root-knot nematodes'grindingextract was better than soaking.

root-knot nematode;extract;tomato-leaf;callus

S641.2

A

1002-2481（2016）09-1345-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.09.28

2016-05-06

省级大学生创新创业训练项目（2014417）

孙亮亮（1989-），男，河南周口人，在读硕士，研究方向：种子科学与技术。江春为通信作者。