桑黄菌发酵生产特色饲料的多指标正交试验设计

■王英超 金 红 陈丹丹 刘美月 刘丽丽

(1.天津农学院基础科学学院，天津 300384；2.天津农学院农学与资源环境学院，天津 300384）

食用菌深层发酵不仅菌丝体生长速度快、营养利用率高，获得的菌丝体具有多种营养成分和生物活性物质，甚至在发酵液中也含有相当丰富的初级代谢产物（如蛋白质、多糖）和次级代谢产物[1-4]（如黄酮、抗菌素等），这些为开发富含菌丝体、蛋白质和黄酮类物质的新型饲料提供了重要的新资源。传统饲料原料如麸皮等纤维素含量高，粗蛋白含量低，缺乏黄酮等免疫活性物质，不利于动物消化吸收[5]。食用菌生长过程中分泌的一系列活性物质既丰富了饲料的营养成分，又提高了饲料口感，还增强了动物的抗病能力，在营养价值和动物吸收利用等方面均优于普通饲料，经济效益明显。本文采用桑黄菌（Phelli⁃nus igniarius，锈革孔菌属多孔菌科[6]）为材料，利用深层发酵培养，测定发酵液中菌丝体生物量、黄酮含量和可溶性蛋白含量，通过多指标正交试验筛选出桑黄菌深层发酵生产黄酮、可溶性蛋白和菌丝体生物量的优化培养基配方，以期为我国新型饲料的研究开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

桑黄菌，天津农学院生物技术实验室保藏菌种。

1.2 试剂

葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、尿素、(NH4)2SO4、Mg⁃SO4、KH2PO4均为国产分析纯。蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、牛血清白蛋白、槲皮素对照品购自上海鼎国生物技术有限公司，麦麸、玉米粉购自天津红旗农贸批发市场。

1.3 方法

1.3.1 一级及二级种子液的接种及培养

将0.5 cm2菌块接入固体平板，27℃暗培养至平板长满菌丝。取0.5 cm2两块菌块接入一级种子液中，25℃培养箱中静置2 d。27℃、150 r/min摇床培养7 d。吸取一级种子液10 ml接入二级培养基中，27℃、150 r/min培养7 d。

1.3.2 碳源及氮源筛选

碳源筛选基础培养基为：蛋白胨2 g/l、KH2PO42 g/l、MgSO41 g/l，pH值自然。分别添加30 g/l的蔗糖、乳糖、麦芽糖、玉米粉和麦麸，研究不同碳源对桑黄菌丝体生物量、可溶性蛋白含量及黄酮含量的影响。氮源筛选基础培养基为：葡萄糖30 g/l、KH2PO42 g/l、MgSO41 g/l，pH值自然。分别添加2 g/l的牛肉膏、酵母浸膏、麦麸、尿素和(NH4)2SO4，研究不同氮源对桑黄菌丝体生物量、可溶性蛋白含量及黄酮含量的影响。

1.3.3 菌丝体生物量的测定

将桑黄发酵液3 000 r/min离心10 min，去掉上清液后得到桑黄菌丝体，用蒸馏水洗涤菌丝体至无色，于恒温干燥箱中60℃条件下烘干至恒重，电子天平称量并记录。

1.3.4 发酵液中黄酮含量和可溶性蛋白含量的测定

取桑黄菌株7 d的发酵液3 000 r/min离心10 min，取上清液进行黄酮和可溶性蛋白含量的测定[7-8]。以槲皮素浓度(mg/ml)为横坐标，以吸光度为纵坐标，在285 nm波长下比色测定，绘出黄酮标准曲线，方程为y=36.800x+0.007 4，R2=0.996 7。以蛋白质浓度（mg/ml）为横坐标，以吸光度为纵坐标，在595 nm波长下比色测定，绘出标准曲线。得到回归线性方程为：y=5.851 4x+0.002 1；R2=0.997 1。

1.3.5 正交试验

根据筛选出的碳源和氮源，结合基础培养基，进行4因素4水平正交试验，因素水平表见表1。

表1 4因素4水平正交试验

2 结果

2.1 桑黄菌丝体生物量的变化

桑黄菌二级种子液接种4 d后菌丝体生物量的变化见图1。由图1可见，在发酵过程中，菌丝体生物量随培养时间的增加而增加。在第4 d培养时出现菌丝体，第7 d时，菌丝体生物量达到最高6.097 mg/ml。7 d后菌丝生物量开始逐渐下降。发酵液中菌丝的形态由原来紧密扭结的球状菌丝表面附有大量白色絮状物，发酵液由澄清变为浑浊，随着培养时间继续增加，球状菌丝消失，菌丝变成细而短的片段，此时发酵液为糊状液体。因此，桑黄深层培养7 d可获得最大菌丝体生物量。

图1 桑黄菌丝体生物量的变化

2.2 桑黄发酵过程中黄酮含量变化曲线(见图2)

图2 桑黄发酵过程中黄酮含量变化曲线

由图2可知，培养时间在4～7 d，黄酮的产量不断增加，7 d时达到最大值0.200 mg/ml。7～10 d，黄酮含量明显下降。此时发酵液颜色呈现亮黄色。因此选择发酵7 d作为桑黄产黄酮的最佳培养时间。

2.3 桑黄发酵过程中可溶性蛋白含量变化曲线

结果见图3。由图3可知，桑黄发酵液中可溶性蛋白的含量变化不大，范围在0.31～0.41 mg/ml，培养7 d时达到最大值0.41 mg/ml。因此选择发酵7 d作为桑黄产可溶性蛋白的最佳培养时间。

图3 桑黄发酵过程中可溶性蛋白含量变化

2.4 碳源的筛选

采用不同的碳源对桑黄进行培养，结果见图4。由图4可知，桑黄在添加蔗糖的条件下，菌丝体生物量为4.452 mg/ml添加麦芽糖，菌丝体生物量为4.195 mg/ml。在以麦麸和玉米粉为碳源的情况下，桑黄菌丝体生物量仅为蔗糖和麦芽糖的一半。乳糖作为碳源，菌丝体生物量低于蔗糖和麦芽糖。

不同碳源在桑黄深层培养过程中对可溶性蛋白及黄酮含量的影响结果见图5、图6。在有麦麸的条件下，黄酮的含量最大为0.270 mg/ml。而有麦芽糖、乳糖、蔗糖的条件下，黄酮含量差异不大。具体表现为0.199、0.228、0.224 mg/ml。以黄酮为主要参考指标时，麦麸为最佳碳源。不同的碳源下可溶性蛋白含量存在明显差异性。具体表现为：麦麸＞玉米粉＞乳糖＞麦芽糖＞蔗糖。以可溶性蛋白含量为参考指标时，麦麸也为最佳碳源。综合菌丝体生物量、黄酮含量、可溶性蛋白含量3个指标，本试验筛选出麦麸作为最佳碳源。

图4 不同碳源对桑黄深层发酵物中菌丝体生物量的影响

图6 不同碳源对桑黄深层发酵物中可溶性蛋白含量的影响

2.5 氮源的筛选

采用不同的氮源对桑黄液体深层培养进行筛选，结果见图7。由图7可知，不同氮源下黄酮含量大小为：酵母浸膏＞牛肉膏＞尿素＞硫酸铵＞麦麸。以黄酮为参考指标，筛选出酵母浸膏作为培养用氮源。不同的氮源对桑黄蛋白质的产量也有较大的影响，结果见图8。由图8可以看出，可溶性蛋白的含量大小依次为：酵母浸膏＞牛肉膏＞硫酸铵＞麦麸＞尿素。桑黄能够很好地利用有机氮源来进行蛋白质的生物合成（除了麦麸以外），而无机氮源也能使桑黄进行蛋白质的生物合成生产蛋白质，但是利用效果不比有机氮源。不同氮源对桑黄菌丝体生物量的影响结果见图9。桑黄菌丝体生物量大小依次为：尿素＞牛肉膏＞硫酸铵＞酵母浸膏＞麦麸。综合黄酮、可溶性蛋白、菌丝体生物量3个指标考虑，选择酵母浸膏作为最佳氮源。

图7 不同氮源对桑黄深层发酵物中黄酮含量的影响

图8 不同氮源对桑黄深层发酵物中菌丝体生物量的影响

图9 不同氮源对桑黄深层发酵物中可溶性蛋白含量的影响

2.6 正交试验设计

在单因素试验的前提下，进行4因素4水平正交试验设计。以桑黄发酵液中菌丝体生物量、黄酮含量和可溶性蛋白含量为主要考察指标，正交试验结果如表2所示。

由表2可知，以桑黄菌丝体生物量为考察指标的培养基最优方案为A2B4C3D2，以黄酮含量考察指标的培养基最优方案为A4B3C3D2，以可溶性蛋白含量为考察指标的培养基最优方案为A3B4C2D3。这3个方案不完全相同，因此采用综合平衡法[7]进行多指标影响分析，获得能兼顾菌丝体生物量、黄酮和可溶性蛋白3个指标均衡的培养基优化方案。

从表2看出，因素A(麦麸)对各指标的影响：黄酮含量、可溶性蛋白含量和菌丝体生物量的极差均较大，说明麦麸是影响最大的因素。对黄酮来讲，A4水平最好，对菌丝体生物量和可溶性蛋白含量来讲，A4水平也不是太差。综合来说，针对3个指标，麦麸取A4水平；因素B（酵母浸膏）对各指标的影响：3个指标的极差均较大，说明酵母浸膏是仅次于麦麸的影响因素。对黄酮来讲，B3水平最好，B4水平也不是太差。对可溶性蛋白和菌丝体生物量来讲，B4水平最好。针对3个指标，酵母浸膏取B4水平；因素C（KH2PO4）对各指标的影响：黄酮含量和可溶性蛋白含量的极差都不是最大，也就是说KH2PO4影响不大，对菌丝体生物量和黄酮含量来讲，均以C3水平最好；对可溶性蛋白含量，C2水平最好，C3也不是太差。针对3个指标，KH2PO4取C3水平最好；因素D（MgSO4）对各指标的影响：黄酮含量、菌丝体生物量、可溶性蛋白含量的极差均较小，说明MgSO4是影响最小的因素。以菌丝体生物量和黄酮含量来讲，D2水平最好。以可溶性蛋白含量来讲，取D3水平最好，D2水平也不是太差。针对3个指标，MgSO4取D2水平最好。综上分析，经过综合平衡得到培养基最优方案为A4B4C3D2。在最优方案下进行3组平行验证试验，黄酮含量为1.173 mg/ml，可溶性蛋白含量为1.425 mg/ml，菌丝体生物量为7.448 mg/ml。

3 讨论

综合平衡法是指在正交试验结果分析中先分别考察每个因素对各指标的影响，然后进行分析比较，确定出最好的水平，从而得到最好的试验方案[8]。其原理同加权法一样，都是综合方差分析、因素贡献率和同一因素下不同水平效应差异显著性检验结果来确定试验最优组合。但不同的是，综合平衡法分别考察了每个因素对各指标的影响，更能发现每个因素与指标之间的关系[7]。本文采用综合平衡法，得到富含黄酮、可溶性蛋白和菌丝体生物量的最优培养基配方，相比其他以单一指标为筛选条件来讲更客观合理。

表2 正交试验设计结果

4 结论

以菌丝体生物量、黄酮和可溶性蛋白的含量为综合考察指标，采用多指标正交试验设计筛选出黄酮含量、可溶性蛋白含量和菌丝体生物量均较高的培养基配方。最优培养基配方为麦麸6%、酵母浸膏0.5%、KH2PO40.2%、MgSO40.1%。在最优培养基配方下进行3组验证试验，得到黄酮含量为1.173 mg/ml，可溶性蛋白含量为1.425 mg/ml，菌丝体生物量为7.448 mg/ml。配方经过优化后生产出的发酵液富含黄酮和可溶性蛋白，营养丰富，可以作为动物特色营养饲料成分使用。