淫羊藿苷对阿尔茨海默病大鼠模型COX-2表达的影响

甄 瑾，王梅玲，朱润秀，肖 梅，傅永旺，郭建雄



淫羊藿苷对阿尔茨海默病大鼠模型COX-2表达的影响

甄 瑾，王梅玲，朱润秀，肖 梅，傅永旺，郭建雄

目的 观察淫羊藿苷(ICA)对脂多糖(LPS)诱导的阿尔茨海默病(AD)炎症模型大鼠海马内环氧酶-2(COX2)表达的影响。方法 将36只Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、ICA低剂量组[ICA30 mg/(kg·d)]、ICA高剂量组[ICA120 mg/(kg·d)]，侧脑室注射脂多糖建立AD炎症模型(对照组注射生理盐水)，连续灌胃2周，每天1次，断头取脑，免疫组化法(SP法)检测大鼠海马内COX-2蛋白的表达，用图像分析系统对染色结果进行分析；通过SYBR GREENⅠ荧光定量PCR检 测大鼠海马内COX-2 mRNA的表达情况。结果 与模型组相比，高剂量组COX-2蛋白及mRNA的表达明显降低(P<0.01)，但仍明显高于对照组(P<0.01)，低剂量组COX-2蛋白及mRNA的表达与模型组比较无统计学意义(P>0.05)。结论 高剂量淫羊藿苷可降低AD炎症模型大鼠海马内COX-2的表达，可抑制炎症反应对神经细胞的损伤。

阿尔茨海默病；淫羊藿苷；内环氧酶-2；脂多糖

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种常见的老年神经变性疾病，临床上表现为隐匿起病、缓慢进展、逐渐加重的痴呆和精神行为异常，是痴呆的最常见原因。随着世界人口老龄化，痴呆已成为老年人群中继心血管病、癌症、中风之后的第四大“杀手”，为家庭和社会带来严重的负担。AD的病因和发病机制尚未明了，目前认为是遗传、环境等多因素致病的复杂病理过程。证据显示炎症反应机制在AD的发病和进展中发挥着重要作用。流行病学研究结果显示：长期服用非甾体抗炎药可以明显降低AD的发病率，并尝试用抗炎药物治疗AD。治疗AD的中医方剂中淫羊藿占有重要地位，淫羊藿提取物淫羊藿苷(Icariin，ICA)具有抗炎作用。本实验旨在观察ICA治疗后的AD炎症模型大鼠海马内环氧酶合-2(COX-2)的表达，并探讨ICA对AD模型的作用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 RM八臂迷宫分析测试系统，JD801图像分析系统，7300实时荧光PCR仪，S-P试剂盒，DAB显色液，抗COX-2多克隆抗体浓缩型，反转录酶，COX-2引物，GAPHD引物，淫羊藿苷，脂多糖。

1.2 实验动物 健康普通成年雄性Wistar大鼠36只，体重200 g～260 g，购自内蒙古大学实验动物中心，均为清洁级动物，分组分笼饲养，充分光照，每12 h明暗交替，控制室温18 ℃～21 ℃，标准饲料喂养，自由进水，在进行八臂迷宫实验前限制大鼠饮食，使其体重维持在自由进食体重的80%～85%。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组及AD模型制备 八臂迷宫训练成功[1]的Wistar大鼠36只随机分为4组，分别为对照组、模型组、低剂量组[ICA30 mg/(kg·d)]、高剂量组[ICA120 mg/(kg·d)]，每组Wistar大鼠9只。大鼠八臂迷宫训练成功后次日通过侧脑室注射5 μg/μL LPS溶液10 μL诱导AD炎症模型。定位参照George Paxinos[2]的《大鼠脑立体定位图谱》。造模后次日八臂迷宫实验观察大鼠的空间记忆能力以判定模型的成败[1]。

1.3.2 给药方法及取材 大鼠侧脑室注射后次日起，连续相应灌胃14 d，每天1次，对照组和模型组给予蒸馏水灌胃，低剂量组给予ICA30 mg/(kg·d)灌胃，高剂量组给予ICA120 mg/(kg·d)灌胃。八臂迷宫测试完成后24 h内2%戊巴比妥钠腹腔麻醉(40 mg/kg～50 mg/kg)。断头取脑，一侧大脑立即放入液氮保存，用于RT-PCR 定量检测；另一侧多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片。

1.3.3 免疫组织化学法 参照津脉公司提供的免疫组化试剂盒检测步骤进行免疫组化S-P法染色检测COX-2的表达。COX-2蛋白均定位于胞浆，细胞浆出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。每张切片随机观察5个高倍视野，利用生物医学图像分析系统对图像进行分析，测定灰度值。

1.3.4 RT-PCR检测 提取RNA并反转录，应用SYBR GREENⅠ荧光定量PCR检测AD模型大鼠大脑海马组织内COX-2mRNA表达，具体方法参照试剂盒说明书进行。结果分析处理用相对定量方法测定。基因表达量=2-△CT，用△CT法计算干扰结果，公式为：△CT未知样品=CT未知样品-CT内参，内参为大鼠持家基因GAPDHmRNA。

2 结 果

2.1 各组大鼠海马内免疫组化COX-2的表达 免疫组化染色显示各组海马内均有COX-2的表达。与 模型组比较，高剂量组COX-2表达明显减少(P<0.01)，但仍明显高于对照组(P<0.01)；低剂量组 COX-2的表达与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

2.2 各组大鼠海马内COX-2mRNA的表达 与模型 组比较，高剂量组COX-2mRNA的表达明显减少(P<0.01)，但仍明显高于空白对照组(P<0.01)；低剂量组COX-2mRNA的表达与模型组比较无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 COX-2在各组大鼠海马内的表达(±s)

3 讨 论

研究发现AD脑组织中炎症反应标志物有增高趋势，脑组织的淀粉样斑块中有多种补体因子及抑制因子。AD病人脑内的β淀粉样蛋白(Aβ)可激活小胶质细胞、星形胶质细胞产生炎症反应，并通过炎症介质如IL-1、IL-6、COX-2等引起神经元的损害。花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代谢通路是炎症的核心网络，环氧合酶(cyclooxygenases，COXs)是 AA 代谢途径中的关键酶，会导致一系列炎症因子的产生，在AD发病机制中起重要作用[3]。在AD的非常早期阶段，当β淀粉样蛋白只有少量沉积，皮质区极少量神经纤维缠结的时候，神经元内COX-2表达即增多，其表达水平与炎症的严重程度呈正相关[4]。 COX-2是核因子信号转导的靶目标之一，证据表明核因子κB(NF-κB)、COX-2与AD的炎性反应过程关系密切，COX-2及其产生的NF-κB信号通路参与神经元的死亡机制[5-6]。长期服用抑COX的非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)可明显降低AD发病相对危险系数[7]，但严重的胃肠道毒副作用限制了传统 NSAIDs在AD病人中的应用。Heneka等[8]的研究证实非甾体类抗炎药物布洛芬能减少转基因小鼠MG和星型胶质细胞的活化数量，降低COX-2的产生而减轻大脑组织的氧化损伤。抑制活化的COX-2可能通过抑制炎症反应和自由基损伤，进而改善老年性痴呆的认知能力障碍。本研究结果显示，AD炎症模型给予高剂量ICA治疗后COX-2表达明显减少，表明ICA可抑制中枢炎症反应、抑制胶质细胞的活化与增殖进而改善AD模型大鼠的学习记忆能力。

[1] 甄瑾，李润今，王梅玲.淫羊藿苷对阿尔茨海默病炎症模型大鼠记忆能力及其海马内GFAP，TNF-α，IL-6表达的影响[J].中西医结合心脑血管杂志，2013，11(2):192-194.

[2] George Paxinos，Charles Wharles Watson.The rat brain in stereotaxic coordinates [M].诸葛启，译.第3版.北京:人民卫生出版社，2005：6.

[3] Sanchez-Mejia RO，Mucke L.Phospholipase A2and arachidonic acid in Alzheimer’s disease[J].Biochim Biophys Acta，2010，1801：784-790.

[4] Sobolewski C，Cerella C，Dicato M，et al.The role of cyclooxygenase-2 in cell proliferation and cell death in human malignancies[J].Int J Cell Biol，2010，5：1-21.

[5] Imbimbo BP，Solfrizzi V，Panza F.Are NSAIDs useful to treat Alzheimer’s disease or mild cognitive impairment? [J].Front Aging Neurosci，2010，26(1):156-160.

[6] Mandrekar S，Jiang Q，Lee CY，et al.Microglia mediate the clearance of soluble Abeta through fluid phase macropinocytosis[J].J Neurosci，2009，29：4252-4262.

[7] Imbimbo BP， Solfrizzi V， Panza F.Are NSAIDs useful to treat Alzheimer’s disease or mild cognitive impairment? [J].Front Aging Neurosci，2010，2：1.

[8] Heneka MT，Sastre M，Dumitrescu-Ozimek L，et al.Acute treatment with the PPARγ agonist pioglitazone and ibuprofen reduces glial inflammation and Aβ1-42 levels in APPV717I transgenic mice[J].Brain，2005，128(6)：1442-1453.

(本文编辑郭怀印)

The Influence of Icariin on the Expression of COX-2 in Rats with Alzheimer-like Model

Zhen Jin，Wang Meiling，Zhu Runxiu，Xiao Mei，Fu Yongwang，Guo Jianxiong

Inner Mongolian People’s Hospital，Huhhot 010017， Inner Mongolia，China

Objective To investigate the influence of icariin (ICA)on the expression of cyclooxygramse 2 (COX-2)in inflammational rat model hippocampus with Alzheimer’s disease(AD) induced by lipopolysaccharides(LPS). Methods Thirty-six rats were allocated into 4 groups:control group，model group，low-dose ICA group and high-dose ICA group.The rat models of AD were induced by being injected LPS into the lateral cerebral ventricle. After two weeks of intragastric administration，brain tissue of rats was removed. The expressions of COX-2 protein and mRNA in hippocampus of the rats were detected by immunohistochemistry(SP method)and SYBR GREEN fluorescence quantitative RT-PCR. Results The expressions of COX-2 protein and mRNA in high-dose ICA group were significantly lower than those in model group (P<0.01). Conclusion The high-dose ICA can reduce the expression of COX-2 in inflammational rat model hippocampus of AD and can inhibit the inflammatory reaction of nerve cells injury.

Alzheimer’s disease;icariin；cyclooxygramse 2；lipopolysaccharides

内蒙古自然科学基金(No.200711020933)

内蒙古自治区人民医院(呼和浩特 010017)，E-mail:zhenjin2006106@126.com

引用信息：甄瑾，王梅玲，朱润秀，等.淫羊藿苷对阿尔茨海默病大鼠模型COX-2表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2016，14(22)：2629-2630.

R743 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.22.012

1672-1349(2016)22-2629-02

2016-05-02)