黄芪多糖对H2O2所致乳鼠心肌细胞凋亡的影响

沈玉珏



黄芪多糖对H2O2所致乳鼠心肌细胞凋亡的影响

沈玉珏

目的 研究黄芪多糖(APS)对H2O2所致乳鼠心肌细胞凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制。方法 分离并培养乳鼠心肌细胞72 h后分为：空白对照组、H2O2组、APS(20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L)+H2O2组，每组设10个复孔；给药干预24 h后，MTT法检测细胞存活率，通过流式细胞术(Flow Cytometry)检测细胞凋亡状况并计算凋亡率；测定细胞中抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)]活性和丙二醛(MDA)含量，培养液中心肌酶[谷草转氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)]含量，Western blot法检测细胞中NF-κB、caspase-3蛋白表达并进行半定量分析，RT-PCR法检测AKT mRNA、bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达并计算bcl-2/Bax表达比值。结果 与H2O2组比较，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2组细胞存活率显著升高，细胞凋亡率显著降低；细胞中SOD、CAT活性显著升高且MDA含量显著降低，培养液中AST、CPK、LDH含量显著降低，细胞中caspase-3、NF-κB蛋白表达量显著降低，AKT mRNA和bcl-2 mRNA表达显著上调，Bax mRNA表达显著下调，bcl-2/Bax表达比值显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论 APS可能通过改善抗氧化酶活性、降低氧化应激损伤、降低NF-κB、caspase-3蛋白表达、上调抗凋亡基因表达并下调促凋亡基因表达、提高bcl-2/Bax表达比值，从而对H2O2诱导乳鼠心肌细胞凋亡起抑制作用。

黄芪多糖；心肌细胞；超氧化物歧化酶；过氧化氢酶；心肌酶

目前，冠状动脉粥样硬化性心脏病及其所引发的急性心肌梗死已经逐渐发展成为常见病和多发病，严重危害着人们的生命健康和生活质量；临床上主要采取溶栓、介入支架手术等治疗手段及时恢复血流供应，能够挽救部分心肌梗死病人生命，但“再灌注损伤”并发症的存在往往严重影响着心肌梗死病人预后。缺血再灌注损伤发病机制非常复杂，其中继发性心肌细胞凋亡是其重要的病理基础[1-2]。黄芪多糖(Astraglus polysaccharides，APS)是我国传统中药黄芪的主要活性成分之一[3]，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗肿瘤、增强机体免疫功能等多种药理学作用[4-8]。本实验将通过H2O2诱导制备乳鼠心肌细胞损伤模型，研究APS对H2O2所致乳鼠心肌细胞凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验药物与试剂 黄芪多糖(西安沃森生物科技有限公司，批号：20131205)； DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；甲基四唑蓝(MTT，美国Sigma公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)；谷草转氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(上海时代生物科技有限公司)；核转录因子(NF-κB)、caspase-3单克隆抗体(碧云天生物技术有限公司)；AKT、bcl-2、Bax上下游引物(上海博亚生物公司)。

1.2 实验动物 清洁级雄性SD大鼠1 d～3 d乳鼠[9]，购自河北省实验动物中心，许可证号：SCXK(冀)2008-1-003，动物合格证号：150406007。

1.3 主要仪器 SW-4T-2F洁净工作台(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)； NU-4850E型CO2培养箱(美国Nu Aire公司)；VCX750型超声波细胞破碎仪(美国SONICS公司)；UV762型紫外-可见分光光度计(上海楚定分析仪器有限公司)；BS-300型全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；iMark型酶标仪、FACS Aria型流式细胞仪(美国BD公司)；DYY-11 型多用电泳仪、JY-SCZ2电泳槽(北京六一仪器厂)；RT-PCR仪(武汉新未来仪器技术有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 乳鼠心肌细胞的分离、培养[9]与分组 细胞的分离：无菌环境下开胸取心脏并剪取心室组织，剪碎、加入0.1%的胰酶后于37 ℃振荡消化6 min，去上清、沉淀继续用0.1%胰酶于37 ℃振荡消化6 min，如此循环直至组织碎块消化完毕，收集消化上清液，1 500 r/min离心10 min，取沉淀，加入心肌细胞培养基(10%胎牛血清 DMEM，内含105 U/L的青霉素和链霉素)，吹打均匀，壁立 1.5 h。收集未贴壁细胞，调整细胞至 6×108个/L，接种于35 mm培养器皿中，37 ℃，5% CO2，100%湿度，培养72 h后，将状态良好的原代乳鼠心肌细胞随机分为：空白对照组、H2O2(200 μmol/L)组、APS(20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2(200 μmol/L)组，每组设10个复孔；经药物干预24 h后，检测各指标。

1.4.2 细胞存活率的检测 参照王知斌等[10]报道的实验方法测定各组细胞存活率：药物干预24 h后，将细胞接种于96孔培养板(n=6)，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h后弃上清，每孔加入150 μL 二甲基亚砜(DMSO)振荡15 min，通过酶标仪检测490 nm处OD值，然后计算细胞存活率：

细胞存活率(%)=(实验组OD值/空白对照组OD值)×100%

1.4.3 细胞凋亡的检测及细胞凋亡率的计算 药物干预24 h后，经0.25%的胰酶消化后离心弃上清液，PBS溶液将冲洗2次后，按照AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒操作方法步骤依次进行处理，避光孵育10 min后行Flow Cytometry检测，观察各组细胞凋亡状况并在流式二维图中计算凋亡率。

1.4.4 细胞中SOD、CAT活性和MDA含量的测定 药物干预24 h后，弃培养基取细胞，每孔加入2 mL PBS溶液，于冰浴中破碎处理30 s后，低温离心取上清液，然后通过紫外-可见分光光度计平行测定各组细胞裂解液中SOD、CAT活性和MDA含量。

1.4.5 培养液中AST、CPK、LDH含量的测定 药物干预24 h后，分别取各组培养液并按照各试剂盒操作方法进行处理，然后通过全自动生化分析仪平行测定各组细胞培养液中AST、CPK、LDH含量。

1.4.6 细胞中NF-κB、caspase-3蛋白表达的检测 取1.4.3制备的细胞裂解提取液，经12 000 r/min低温离心10 min后取沉淀，行BCA法蛋白定量，变性后上样，经电泳、转膜、春红溶液染色后，室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗(NF-κB， caspase-3，β-actin)4 ℃过夜；洗膜，二抗室温摇床上孵育1 h后经ECL显色，实验结果应用Quantity One软件进行分析。

1.4.7 细胞中AKT mRNA、bcl-2mRNA、Bax mRNA表达的检测及bcl-2/Bax比值的计算 查阅大鼠AKT、bcl-2、Bax、β-actin基因cDNA序列并通过Oligo软件设计上、下游引物：AKT：上游5′-TTTATTGGCAGGGAACG-3′，下游5'-AGTCTG AATGGCGGTGGT-3′，扩增片段长度为213bp；bcl-2上游5′-CCTTTGTGTAACT GTACGGCC-3′，5′-CTTTGGCAGTAAATAGCTGATTCGAC-3′，扩增片段长度为317bp；Bax上游5′-GGATGCGTCCACCAAGAA-3′，下游5′-TCCCGGAGGAAGT CCATT-3′，扩增片段长度282 bp；β-actin上游5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAA -3′，下游5′-AAAGAAAGGGAGTAAACCGCA-3′，扩增片段长度432bp。常规消化后收集各组细胞，加入适量TRIzol试剂提取总RNA并测定总RNA浓度，取1 μg RNA反转录为cDNA，然后进行PCR反应，扩增完毕后，取PCR产物于琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察并照相。以β-actin为内参，由灰度值进行半定量分析AKT mRNA、bcl-2mRNA、Bax mRNA表达，并计算bcl-2/Bax表达比值。

2 结 果

2.1 各组细胞存活率 与空白对照组比较，H2O2组乳鼠心肌细胞存活率显著降低(P<0.01)；与H2O2组比较，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2组细胞存活率显著升高(P<0.01)。详见表1。

2.2 各组细胞凋亡状况 空白对照组乳鼠心肌细胞存在极少量凋亡细胞，H2O2组细胞凋亡数量较空白对照组明显增多；而经APS干预24 h后，能够显著改善H2O2诱导损伤乳鼠心肌细胞凋亡状况，以APS(80 μmol/L)+H2O2组效果最为显著(见图1)。计算凋亡率发现：与空白对照组比较，H2O2组细胞凋亡率显著增高(P<0.01)；而与H2O2组比较，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2组细胞凋亡率显著降低(P<0.01)。详见表1。

注：A为空白对照组；B为H2O2组；C为APS(20 μmol/L)+H2O2组； D为APS(40 μmol/L)+H2O2组；E为APS(80 μmol/L)+H2O2组。图1 各组细胞凋亡情况表1 各组细胞存活率和凋亡率(±s) %

2.3 各组细胞中SOD、CAT活性和MDA含量 与空白对照组比较，H2O2组乳鼠心肌细胞SOD、CAT活性显著降低，且MDA含量显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与H2O2组比较，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2组SOD、CAT活性显著升高，且MDA含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表2。

表2 各组细胞中SOD、CAT活性和MDA含量(±s)

2.4 各组细胞培养液中AST、CPK、LDH含量 与空白对照组比较，H2O2组乳鼠心肌细胞培养液中AST、CPK、LDH含量显著升高(P<0.01)；与H2O2组比较，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2组AST、CPK、LDH含量均显著降低(P<0.05或P<0.01)。详见表3。

表3 各组细胞培养液中AST、CPK、LDH含量(±s)

2.5 各组细胞NF-κB、caspase-3蛋白表达 通过Western blot检测并进行半定量分析发现：与空白对照组比较，H2O2组乳鼠心肌细胞中NF-κB、caspase-3蛋白表达量显著增高(P<0.01)；与H2O2组比较，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2组NF-κB、caspase-3蛋白表达量均显著降低(P<0.05或P<0.01)。详见图2和表4。

注：A为空白对照组；B为H2O2组；C为APS(20 μmol/L)+H2O2组； D为APS(40 μmol/L)+H2O2组；E为APS(80 μmol/L)+H2O2组。图2 各组细胞凋亡情况表4 各组NF-κB、caspase-3蛋白表达量(±s)

2.6 各组细胞AKT mRNA、bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达及bcl-2/Bax比值 与空白对照组比较，H2O2组细胞AKT mRNA、bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达显著升高(P<0.05或P<0.01)，bcl-2/Bax比值显著降低(P<0.01)；与H2O2组比较，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2组AKT mRNA、bcl-2 mRNA表达显著升高，而Bax mRNA表达显著降低(P<0.05或P<0.01)，bcl-2/Bax比值显著升高(P<0.01)。详见表5。

表5 各组细胞AKT mRNA、bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达及bcl-2/Bax比值(±s)

3 讨 论

细胞凋亡是一种由多种基因参与调控的程序化死亡过程，AKT为抗凋亡基因，在细胞凋亡的启动及整个过程中发挥着重要的调控作用[11]；Bcl-2家族基因在细胞凋亡过程中也发挥着重要的调控作用，其中bcl-2为抑凋亡基因、Bax为促凋亡基因，二者间相互作用共同调控细胞凋亡过程[12]；并且bcl-2和Bax对细胞凋 亡的调控不仅与二者表达程度有关，可能更依赖于bcl-2/Bax表达比值，bcl-2/Bax比值越低往往凋亡状况越严重[13]；Caspases 蛋白家族参与细胞凋亡启动以及整个过程的调节，其中caspase-3被认为是各种凋亡刺激因子激活的关键蛋白酶[14]。

细胞凋亡具有多种诱发因素，包括氧化应激损伤[15]。NF-κB为多效能核转录因子，被称为连接氧 化应激损伤和细胞凋亡的“桥梁”[16]。生理状态下，NF-κB以无活性形式存在于胞质中，而当细胞受到ROS攻击时，NF-κB将被活化并暴露出核定位信号而进入胞核内；Zhang等[17]研究发现：活化NF-κB能够促进巨噬细胞活化和浸润，诱导促凋亡信号释放而导致细胞凋亡，证实NF-κB激活与氧化应激诱导的心肌细胞凋亡密切相关。正常生理状态下，体内生成的ROS在SOD和CAT的依次催化作用下最终还原生成对人无害的H2O和O2[18-19]，因此SOD、CAT的活性直接反映机体抗氧化能力。此外，血清中脂质过氧化终产物MDA的含量也能够间接反映细胞损伤程度。正常生理状态下，血清中心肌酶含量非常低，而当细胞膜受氧自由基攻击而受损后将导致细胞中心肌酶(AST、CPK、LDH)迅速释放入血，导致血清中AST、CPK、LDH活性陡然增高，因此血清中三者的活性水平能够敏感地反映心肌细胞受损程度，它们也是临床上监测心功能的常用指标。

本实验研究发现：与空白对照组比较，经APS干预24 h能够有效提高H2O2诱导损伤乳鼠心肌细胞存活率、降低细胞凋亡率、改善抗氧化酶活性、抑制心肌细胞损伤、上调抗凋亡基因AKT和bcl-2表达、下调促凋亡基因Bax基因表达、提高bcl-2/Bax表达比值、降低caspase-3和NF-κB蛋白表达，提示APS对H2O2所致乳鼠心肌细胞凋亡具有抑制作用，其作用机制可能与APS能够有效抑制氧化应激损伤以及调节凋亡相关基因和蛋白表达有关。

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(本文编辑郭怀印)

Effects of Astraglus Polysaccharides on the Cadiocytes Apoptosis Induced by H2O2in Neonatal Rat

Shen Yujue

Handan Central Hospital，Handan 056001，Hebei，China

Objective To investigate the effects of astraglus polysaccharides (APS) on the cadiocytes apoptosis induced by H2O2in neonatal rat. Methods Cadiocytes of neonate rat was cultivated for 72 hours and divided into six groups：normal control group，H2O2group，APS (20，40，80 μmol/L) plus H2O2groups(n=10). Twelve hours after the drugs were given，the survival rate was detected by MTT assay.The cardiomyocytes apoptosis was observed by flow cytometry and the apoptosis rate was calculated.The activity of superoxide dismutate(SOD)，catalase (CAT) and the content of malondialdehyde (MDA) in cardiomyocytes were determinted.The content of aspartate aminotransferase(AST)， creatine phosphokinase(CPK)， lactate dehydrogenase (LDH) in culture medium were detected.The expression of nuclear factor-kappa B(NF-κB)，caspase-3 protein was detected by western blot and Semi-quantitative analysized.The expression of AKT mRNA，bcl-2 mRNA，Bax mRNA were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)and the ratio of bcl-2/Bax was calculated. Results Compared with the H2O2group，the survival rate in APS(40，80 μmol/L) plus H2O2groups was significantly increased.The cardiomyocytes apoptosis was improved and the apoptosis rate was significantly decreased.The activities of SOD，CAT in cardiomyocytes were significantly increased and the content of MDA was significantly decreased.The contents of AST，CPK，LDH in culture medium were significantly decreased.The expression of AKT mRNA，bcl-2 mRNA were significantly up-regulated，while the expression of Bax mRNA was significantly down-regulated，the ratio of bcl-2/Bax was significantly increased.The expression of NF-κB，caspase-3 protein were significantly down-regulated.All of the difference above were significant (P<0.05 or P<0.01). Conclusion APS had inhibitive effects on neonatal rat cadiocytes apoptosis induced by H2O2，which perhaps related to its effects of improving the activity of antioxidase，depressing oxidative stress，down-regulating the expression of NF-κB，caspase-3 protein，up-regulating the expression of anti-apoptotic genes and down- regulating the expression of pro-apoptotic genes，raising the ratio of bcl-2/Bax.

astraglus polysaccharides；H2O2；cardiomyocytes；superoxide dismutate；catalase；myocardial enzymes

河北省邯郸市中心医院(河北邯郸 056001)，E-mail：zhjkhg@163.com

引用信息：沈玉珏.黄芪多糖对H2O2所致乳鼠心肌细胞凋亡的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2016，14(22)：2616-2621.

R329.2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.22.008

1672-1349(2016)22-2616-06

2016-05-04)