参芍胶囊对心肌缺血再灌注损伤大鼠心脏过氧化损伤的影响

赵桂峰，黄欣玮，吴丽玉，毛静远



参芍胶囊对心肌缺血再灌注损伤大鼠心脏过氧化损伤的影响

赵桂峰1，黄欣玮2，吴丽玉2，毛静远1

目的 观察参芍胶囊预处理对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠心脏组织和功能及过氧化损伤、抗氧化能力的影响。方法 采用左冠状动脉前降支结扎30 min，再灌注120 min制备心肌缺血再灌注损伤模型。将30只雄性Wistar大鼠随机分为5组：假手术组、模型组、参芍胶囊250 mg/kg组、参芍胶囊500 mg/kg组和阿托伐他汀组，每组6只。术前用药7 d。再灌注后生理记录仪记录血流动力学变化，生化法检测血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)及心肌组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量。结果 与模型组比较，参芍胶囊高、低剂量组与阿托伐他汀组CK-MB和LDH均明显降低(P<0.05或P<0.01)。与参芍胶囊250 mg/kg组比较，参芍胶囊500 mg/kg组和阿托伐他汀组LDH显著降低(P<0.01)。与模型组比较，参芍胶囊250 mg/kg组左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)值明显升高(P<0.05)；参芍胶囊500 mg/kg组和阿托伐他汀组LVSP和-dp/dtmin值明显升高(P<0.05)，+dp/dtmax值显著升高(P<0.01)，左心室舒张末压(LVEDP)值明显降低(P<0.05)。与模型组比较，参芍胶囊高低剂量组与阿托伐他汀组心肌中丙二醛(MDA)明显降低(P<0.05或P<0.01)，超氧化物气化酶、谷胱甘肽过氧化物酶明显升高(P<0.05或P<0.01)。结论 参芍胶囊预处理能够抑制MIRI后大鼠心肌损伤，改善心脏血流动力学状态，抑制膜脂过氧化产物的生成及提高机体抗氧化损伤能力。

参芍胶囊；心肌缺血再灌注损伤；过氧化损伤；肌酸激酶同工酶

参芍胶囊(Shen shao capsule，SS)由人参茎叶皂甙和白芍制成的中药制剂，其主要药效物质基础为人参皂苷Rg1、Re、芍药苷。具有活血化瘀，益气止痛的功效，适用于气虚血瘀所致的胸闷、胸痛、心悸、气短等症。现代研究表明其药效物质在心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)过程中发挥抗氧化损伤、减轻钙超载和抑制心肌细胞凋亡的作用[1-2]，但未见该复方在防治MIRI方面的报道。本实验采用大鼠在体MIRI模型，观察参芍胶囊预处理对MIRI心脏的保护作用和过氧化机制的影响。

1 材料与方法

1.1 动物和分组 健康成年雄性Wistar大鼠30只[北京维通利华实验动物中心提供，许可证号：SCXK(京)2012-0001]，体重250 g～300 g。随机分为5组：假手术组(Sham)、模型组(I/R)、参芍胶囊250 mg/kg组(SS250)、参芍胶囊500 mg/kg组(SS500)和阿托伐他汀组(Ator)，每组6只。参芍胶囊按照成人正常剂量(8粒/日)和两倍剂量设为高、低剂量组，阿托伐他汀组按照成人10 mg/d剂量并依据人与大鼠体表面积换算。假手术组和模型组予等量生理盐水。预灌胃1周，每天上午给药1次，自由饮食、饮水。

1.2 试剂和仪器 参芍胶囊(保定步长天浩制药有限公司，批号150701)，阿托伐他汀钙片(辉瑞制药有限公司，批号L14582)，肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，酶标仪(BIO RAD，美国)，PowerLab/4SP(ML750，澳大利亚)，全自动生化分析仪(日立7020，日本)，紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司，756MC)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠MIRI模型 将各组大鼠于术前禁食12 h，自由饮水，记录大鼠体重，并于麻醉前1 h灌胃，之后用5%水合氯醛(6 mL/kg)腹腔注射麻醉。仰卧位固定，消毒左侧胸前及腋下皮肤，胸部备皮。记录Ⅱ导联心电图。沿左侧第3、4肋间(或心脏搏动最明显处)剪开左胸皮肤约1 cm，用止血钳逐层分离皮下组织。在心脏搏动最明显处用弯止血钳撑开胸廓，将心脏挤出胸腔，持5/0无创缝合针丝线(上海元洪医疗器械有限公司)，于肺动脉圆锥与左心耳之间，在离左冠状动脉前降支(LAD)起始部约2 mm处进针，深度1 mm左右，在结扎处预先垫一根1/0粗棉线，而后把冠脉及棉线一起进行结扎，第二结为滑结，随后立即把心脏送回胸腔并排气净血，再用直头止血钳夹闭皮肤及肌肉层，造成心肌缺血。心电图示ST段抬高并与T波融合，结扎线下心肌组织发绀，说明心肌缺血模型成功[3-4]。30 min后松开止血钳，恢复血流灌注，S-T段下降1/2以上，标志再灌注成功(见图1)，其中假手术组在冠状动脉前降支下只穿线不进行结扎，其余处理同上。

图1 心电图变化

1.3.2 血流动力学检测 再灌注结束前15 min再次将大鼠麻醉，并分离右颈总动脉，经右颈总动脉行左心 室插管，连压力换能器接放大器，通过多道生理记 录仪，记录左心室收缩未压(LVSP)、左心室舒张 末压(LVEDP)，并记录左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、下降速率(-dp/dtmin)，同步记录心率(HR)。

1.3.3 心肌酶及氧化应激检测 再灌注结束即刻，大鼠腹主动脉取血6 mL，37 ℃水浴锅静置2 h，3 000 r/min离心15 min，按照各试剂盒说明书检测血清中CK-MB、LDH水平。再灌注结束后，剪破左心耳，用冰氯化钠注射液经腹主动脉将心脏冲洗干净并剪下用滤纸吸干。以生理盐水为介质，用匀浆器制成10%心肌组织匀浆。SOD、MDA和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量的测定按照试剂说明书进行。

2 结 果

2.1 大鼠CK-MB和LDH比较 与假手术组比较，模型组大鼠血清中CK-MB和LDH活性均显著增加 (P<0.01)；与模型组比较，参芍胶囊250 mg/kg组CK-MB和LDH活性均明显降低(P<0.05)，参芍胶 囊500 mg/kg组CK-MB和LDH活性均显著降低(P<0.05或P<0.01)，阿托伐他汀组也呈降低趋势(P<0.01)；与参芍胶囊250 mg/kg组比较，参芍胶囊 500 mg/kg组和阿托伐他汀组LDH活性显著降低 (P<0.01)，阿托伐他汀组CK-MB活性明显降低(P<0.05)。详见表1。

表1 参芍胶囊对MIRI大鼠血清CK-MB、 LDH活性的影响(±s) U/L

2.2 大鼠心肌组织SOD、MDA和GSH-PX结果比较 与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中MDA含量显著增加(P<0.01)，SOD、GSH-PX活性显著降低(P<0.01)。与模型组比较，参芍胶囊250 mg/kg组MDA含量明显降低(P<0.05)，SOD、GSH-PX活性明显增高(P<0.05)；参芍胶囊500 mg/kg组及阿托 伐他汀组MDA含量显著降低(P<0.01)，SOD、GSH-PX活性明显增高(P<0.05或P<0.01)。详见表2。

表2 参芍胶囊对MIRI大鼠心肌组织中 SOD、MDA和GSH-PX的影响(±s)

2.3 大鼠心脏血流动力学比较 与假手术组比较，模 型组大鼠LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmin值显著降低，LVEDP值显著升高(P<0.01)；与模型组比较，参芍胶囊250 mg/kg组+dp/dtmax值明显升高(P<0.05)；参芍胶囊500 mg/kg组和阿托伐他汀组LVSP和-dp/dtmin值明显升高(P<0.05)，+dp/dtmax值显著升高(P<0.01)，LVEDP值明显降低(P<0.05)。各组之间HR值比较差异无统计学意义。详见表3。

表3 参芍胶囊对MIRI大鼠血流动力学的影响(±s)

3 讨 论

MIRI指缺血心肌组织在血液重新灌流后，出现更严重、更明显的功能障碍及损伤，甚至导致心肌发生不可逆损伤的现象。其中氧自由基的大量产生导致细胞膜的脂质过氧化，引起细胞膜破坏，导致细胞功能障碍甚至坏死。由氧自由基等导致心肌细胞的能量代谢障碍到心脏收缩舒张功能的异常再到心脏组织细胞的死亡是MIRI的主要病理进展。如何减轻过氧化损伤，改善MIRI后心脏功能的障碍进而减少心肌细胞的死亡仍是当今研究热点，实验研究表明中医药对防治MIRI有显著效果。前期研究发现参芍胶囊在抗大鼠动脉粥样硬化过程中可以增强机体清除氧自由基的能力， 减轻脂质过氧化程度，改善血管内皮细胞功能[5]。

本研究首先从心脏功能障碍和心肌损伤两个方面探讨参芍胶囊对MIRI大鼠心脏的作用。然后进一步研究该药对过氧化损伤的干预机制。本实验发现，大鼠心肌缺血再灌注损伤后LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmin明显下降，而LVEDP明显上升，提示MIRI大鼠左室功能显著下降。经参芍胶囊预干预后各指标均得以明显改善，同时发现参芍胶囊高剂量组在改善心脏功能方面具有更好的效果。在减轻心肌及组织损伤方面，参芍胶囊高、低剂量组均有保护作用，但高剂量组在降低LDH方面优于低剂量组，差异有统计学意义。由于LDH不具有心肌组织的特异性，所以结果可能提示该药对心肌组织具有保护作用，可减轻MIRI后全身的氧化应激损伤，其机制有待进一步研究。氧自由基和不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，其代谢产物为MDA，并具有细胞毒性。SOD、GSH-PX作为氧自由基清除剂，将其催化生成O2和H2O等终产物。在机体自由基代谢过程中，SOD可以将过氧化物自由基转变为过氧化氢，再通过过氧化氢酶的作用分解成为氧气和水。GSH-PX能催化氧化型谷胱甘肽转变为还原型，促进H2O2的分解，从而保护细胞膜的结构及功能。参芍胶囊能够明显降低MDA含量，提高心肌组织中SOD、GSH-PX活性，发挥心肌保护作用。参芍胶囊高低剂量组在清除氧自由基和改善心室功能方面均有效，但高剂量具有更好的趋势。

综上所述，参芍胶囊能够改善MIRI大鼠心脏功能，减轻心肌损伤。其干预机制与减少体内氧自由基的产生和提高机体抗氧化损伤能力有关。氧化应激与炎症在MIRI过程中密切相关，炎症信号通路的激活导致内皮细胞受损，中性粒细胞激活，氧自由基大量产生，促进氧化应激的进展。参芍胶囊两种成分的作用机制及配伍规律将在以后的研究中进一步探讨。

[1] Lim KH，Lim DJ，Kim JH.Ginsenoside-Re ameliorates ischemia and reperfusion injury in the heart：a hemodynamics approach[J].J Ginseng Res，2013，37(3)：283-292.

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(本文编辑郭怀印)

The Influence of Shenshao Capsule Preconditioning on Heart Oxidative Damage in Rats with Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

Zhao Guifeng，Huang Xinwei，Wu Liyu，Mao Jingyuan

First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300381，China

Mao Jingyuan

Objective To observe the effect of Shenshao capsule (SSC)preconditioning on myocardial ischemia reperfusion injury (MIRI)in rat heart and the mechanism of oxidative damage and antioxidant capacity.Methods In this study， besides sham group， the left anterior descending coronary artery of other wistar rats were occluded 30 min and reperfused 120 min in MIRI model.Thirty rats were randomly divided into sham group， ischemia/reperfusion group，low and high dose SSC group (250 mg/kg and 500 mg/kg)，and atorvastatin 10 mg/kg group，pre-treated for 7 days. After the end of the reperfusion，physiological recorder was used to measure the cardiac hemodynamic changes. The contents of serum creatine kinase isoenzyme MB(CK-MB) and lactate dehydrogenase (LDH) and the myocardial tissue malondialdehyde (MDA)， superoxide dismutase (SOD)， glutathione peroxidase (GSH-PX) were detected by automatic biochemical analyzer. Results Compared with model group， the contents of serum CK-MB and LDH were significantly lower in low and high dose SSC group and atorvastatin group(P<0.05 or P<0.01). Compared with low dose SSC group， the content of LDH was significantly lower in high dose SSC group and atorvastatin group (P<0.01).Compared with model group，+dp/dtmaxvalue increased significantly in low dose SSC group(P<0.05).LVSP and -dp/dtmin value increased (P<0.05)， +dp/dtmaxvalue increased significantly (P<0.01)， LVEDP value decreased (P<0.05)in high dose SSC group and atorvastatin group.Compared with model group，the contents of myocardial MDA significantly lower，the contents of SOD and GSH-PX increased significantly in low and high dose SSC group and atorvastatin group(P<0.05 or P<0.01).Conclusion SSC pretreatment can inhibit myocardial injury in rats after MIRI，improve cardiac hemodynamic state，inhibit the generation of membrane lipid peroxidation products and improve the body’s ability to resist oxidative damage.

Shenshao capsule；myocardial ischemia reperfusion injury；oxidative damage；creatine kinase isoenzyme MB

2012年度教育部“创新团队发展计划”中医药防治心血管疾病研究(No.IRT1276)

1.天津中医药大学第一附属医院(天津 300381)；2.天津中医药大学

毛静远，E-mail：jymao@126.com

R542.2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.22.007

1672-1349(2016)22-2613-04

2016-09-19)

引用信息：赵桂峰，黄欣玮，吴丽玉，等.参芍胶囊对心肌缺血再灌注损伤大鼠心脏过氧化损伤的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2016，14(22)：2613-2616.