稳心颗粒对AngⅡ诱导H9C2细胞肥大模型骨架蛋白的影响

任晓萌，陈 钰，李 洁，吴丽君，杨欣宇，吴爱明，邢雁伟，商洪才，高永红



·基础医学论著/研究·

稳心颗粒对AngⅡ诱导H9C2细胞肥大模型骨架蛋白的影响

任晓萌1，3，陈 钰2，李 洁3，吴丽君1，杨欣宇1，3，吴爱明1，邢雁伟3，商洪才1，高永红1

目的 研究稳心颗粒(WXKL)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导H9C2细胞肥大模型骨架蛋白的影响。方法 体外培养H9C2细胞，经血管紧张素Ⅱ诱导复制心肌细胞肥大模型，加入5 g/L稳心颗粒后，观察细胞的形态变化以及对骨架蛋白的影响。结果 经AngⅡ诱导的H9C2心肌细胞形态发生改变，细胞横向拉伸，肿胀变大，细胞体积较正常心肌细胞增大；加入稳心颗粒后 H9C2心肌细胞形态有所恢复，但还是比正常细胞横向宽度增加。应用激光共聚焦显微镜下观察细胞形态发现，正常 H9C2细胞经10-7mol/L AngⅡ刺激48 h后，细胞形态明显肿胀变大，细胞的长度和宽度分别由(120.32±8.36)μm和(51.82±8.62)μm增加到(182.67±7.81)μm和(92.22±7.56)μm。加入稳心颗粒作用 24 h后，AngⅡ组的H9C2心肌细胞形态有所恢复，细胞的长度和宽度为(160.35±5.66)μm、(55.87±4.52)μm。结论 稳心颗粒在AngⅡ诱导的肥厚心肌H9C2细胞模型中，能改善细胞骨架蛋白，起到一定的改善心肌肥厚的作用。

心肌肥厚；H9C2心肌细胞；血管紧张素Ⅱ；稳心颗粒

益气活血中药稳心颗粒(WXKL)是临床上有确切疗效治疗肥厚性心律失常的中成药。而心肌肥厚是伴随许多心血管事件发生过程中出现的病理变化，临床上常见的原发性或继发性高血压、心肌梗死、瓣膜病、先天性心脏病等都会伴有心肌肥厚的发生。虽然早期心肌肥厚是心脏为适应各种刺激而产生的心肌细胞体积增大，重量增加，有利于维持正常的心功能，但由于心肌肥厚本身也可增加心肌耗氧量、降低心肌顺应性，所以长时间肥厚的程度超过心肌所能承受的范围，会导致心力衰竭，增加猝死的发生率[1]。本实验通过建立模拟血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导H9C2细胞肥大模型，观察稳心颗粒对其骨架蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞 H9C2细胞株来源于大鼠胚胎期心脏组织，从中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心(Cell Resource Center，IBMS，CAMS/PUMC)，即北京协和细胞资源中心购买。购买时为第22代。

1.2 药物 稳心颗粒(山东步长制药股份有限公司，批号：120620)；血管紧张素Ⅱ(A9525，Sigma公司，美国)。

1.3 仪器与试剂

1.3.1 实验仪器 二氧化碳(CO2)细胞培养箱(Thermo 公司，美国)，超净工作台(北京半导体设备一厂，中国)，光学倒置显微镜 (型号：Olympus IX70，奥林巴斯，日本)，激光共聚焦[OLYMPUS FLUOVIEW laser scanning confocal microscopes FV1000 Viewer(Ver.1.6)]。

1.3.2 实验试剂 DMEM 高糖液体培养基(北京迈晨科技公司，中国)，胎牛血清(Gibco，美国)，胰酶，双抗(Solarbio 中国)，Rhodamine Phalloidin(Lifetechnologies，R-415)。其他试剂均为国产分析纯。

1.4 实验方法

1.4.1 H9C2心肌细胞的培养 根据实际情况，用改良的细胞培养方法培养H9C2心肌细胞[2]。放置在 37 ℃ 5 % CO2培养箱中于含10 % 胎牛血清的高糖液体培养基中进行培养，24 h后更换细胞培养基。当细胞汇合度达 90%以上时，给予传代培养，一般细胞传代时间控制在细胞培养后 2 d ～ 3 d。

1.4.2 心肌细胞肥大模型建立及实验分组 采用AngⅡ诱导心肌细胞肥大模型[3]。AngⅡ溶液[4]：用去离子水配制成10-5mol/L母液，实验时2 mL的培养基中加入20 μL 10-5mol/L AngⅡ，终浓度达到10-7mol/L，即100 nmol/L，细胞给药48 h。稳心颗粒溶液：用生理盐水配制成终浓度为5 g/L，细胞给药24 h。实验分3组。Control组：正常H9C2细胞，不加药物，培养72 h后进行实验；AngⅡ组：正常H9C2细胞，加AngⅡ培养48 h后再培养24 h；AngⅡ+ WXKL组：正常H9C2细胞，加入AngⅡ48 h 后，再加入WXKL 作用 24 h后进行实验。

1.4.3 倒置显微镜观察细胞形态 将H9C2细胞种植于35 mm培养皿中，用10-7mol/L的AngⅡ刺激48 h后，再用5 g/L WXKL作用 24 h，在普通光学显微镜下观察细胞形态、大小。

1.4.4 激光共聚焦测细胞骨架蛋白 采用免疫荧光染色法，提前1 d按2.5×105/孔密度接种H9C2细胞到激光共聚焦专用玻底96孔板。待细胞长至70%～80%，用PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS冲洗3次，每次5 min。用0.1 % Triton X-100穿透液室温下穿透细胞5 min，用PBS冲洗3次，每次5 min。用PBS稀释(2.5 μL)罗丹明鬼笔环肽成200 μL工作液，固定20 min，用PBS冲洗3次，每次5 min，在激光共聚焦显微镜下观察，分别在各组细胞中随机选取10 个细胞，测定细胞长度和宽度，取平均值，比较各组细胞的大小。

2 结 果

2.1 稳心颗粒对AngⅡ诱导肥大H9C2细胞形态改善作用 Control组的正常细胞呈长梭形，用10-7mol/L AngⅡ刺激48 h的H9C2心肌细胞形态发生改变，细胞横向拉伸，肿胀变大，细胞体积较Control组略有增大。而用5 g/L WXKL作用 24 h后，H9C2心肌细胞形态有所恢复，但比Control组细胞横向宽度增加。详见图1。

注：A为正常H9C2细胞；B为H9C2细胞经10-7mol/L AngⅡ 刺激48 h；C为正常H9C2细胞，加入AngⅡ48 h 后，再加入稳心颗粒作用 24 h后进行实验。

图1 稳心颗粒对血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥厚心肌细胞的影响(×200)

2.2 稳心颗粒对AngⅡ诱导肥大H9C2骨架蛋白的作用(见表1) 在观察细胞形态发现，Control组的H9C2细胞经10-7mol/L AngⅡ刺激48 h后，细胞形态明显肿胀变大(见图2 A)，细胞的长度和宽度增加(P<0.01)(见图2B和图2C)。而用5 g/L WXKL作用 24 h后，AngⅡ组的H9C2心肌细胞形态有所恢复，细胞的长度和宽度降低(P<0.05)(图2D)。

表1 各组细胞长度、宽度比较(±s) μm

注：A为正常H9C2细胞；B为H9C2细胞经10-7mol/L AngⅡ 刺激48 h；C为正常H9C2细胞，加入AngⅡ48 h 后，再加入稳心颗粒作用24 h后进行实验。

与Control 组比较，**P<0.01；与 AngⅡ组比较，#P<0.05，##P<0.01。

图2 稳心颗粒衰减细胞肥大

3 讨 论

心肌肥厚是心脏为适应各种刺激而产生的心肌细胞蛋白合成增加，肌节数量增多并伴有纤维组织增生。其病理变化包括心肌细胞体积增大、重量增加、直径增宽或长度增宽，心肌间质细胞增殖以及心脏细胞外基质改变等方面，即心室重构[5]。心肌重构是心脏在内外因素的刺激下，产生的一系列形态学和功能学适应性变化，随着刺激因素的持续和增强，最终心脏功能失代偿而发展成心力衰竭。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活是引起心肌重构和心力衰竭的最主要内源性因素之一[6]。从细胞和分子水平看，心肌细胞肥大的过程中，机械信号通过刺激生长因子释放AngⅡ激活应力感受器，包括：牵拉敏感离子通达、整合素超家族以及细胞骨架将信号传递至核内[5]。AngⅡ是RAAS系统的重要组成部分，与心血管事件的发生发展是密不可分的，能够直接作用于心肌细胞诱导肥大[6-7]。细胞骨架的改变在心肌肥厚和心肌收缩阻力变化方面的作用近年来逐渐受到重视。有研究显示[8]其本身在心肌细胞肥大、衰竭过程中微管蛋白发生了数量变化，或者稳定性增加，同时细胞黏性系数增加，也说明了细胞骨架改变有可能参与了心肌肥大和心力衰竭的发病过程。心肌细胞的细胞骨架还决定细胞的顺应性[9]。冯冰等[10]利用细胞骨架解聚剂观察了细胞骨架系统在牵张刺激心肌细胞肥大反应中的作用，其理论依据是机械刺激可能通过骨架拉动把力学信息传递进入细胞核而引起心肌肥大反应。牟娇等[11]研究表明细胞骨架是维持细胞结构和正常功能的重要物质基础，在肥大心肌细胞中的变化可能是细胞在外界致病因素作用下代偿性调节的一种表现。由此会影响心肌收缩的阻力，心肌的收缩功能减弱，更容易近一步发展为心力衰竭。同时，细胞骨架作为一种信号传导通路，能够接受细胞来自外界的刺激信号。通过检测肥大心肌细胞骨架蛋白含量及其磷酸化水平，肥大细胞内的主要骨架蛋白成分，包括微管、微丝以及接蛋白等，结果显示：骨架蛋白表达都会有不同程度的异常增加情况，反而其磷酸化水平表现为明显降低。心肌肥大的信号转导机制非常复杂[12]，一般从细胞水平将心肌肥大分为3个环节，即胞外的肥大刺激信号、胞内信号转导以及核内基因转录活化，最终诱导细胞肥大表型变化，如细胞体积增加、收缩蛋白积聚、蛋白合成增加、收缩性蛋白聚合成肌小节单位等。

稳心颗粒作为一个作用于心肌肥厚及治疗心律失常的中药组方，由党参、黄精、琥珀、三七、甘松等复方组成。具有益气养阴、活血化瘀、定悸安神、宁心复脉的功效，是抗心律失常的纯中药制剂，能够抗心律失常，改善心肌供血，降低心肌耗氧量[13]。王国钦等[14]实验显示:稳心颗粒具有恢复心肌肥厚的作用，能恢复心肌细胞的形态以及细胞骨架蛋结构，从而可以逆转心肌肥厚。本研究采用普通光学显微镜和激光共聚焦显微镜观察稳心颗粒对H9C2心肌细胞骨架蛋白的作用。采用荧光免疫法进行荧光染色并观察，研究显示：正常H9C2心肌细胞在经过10-7mol/L AngⅡ诱导后，细胞明显变形，增宽，增长，而在稳心颗粒作用后可以改善由AngⅡ诱导的细胞肥大程度。

对于心肌肥厚，从细胞骨架到信号传导的转向愈加受到关注，其中细胞内钙信号传递是诱导心肌肥大的最重要信号转导通路之一[12]。课题组[15]通过观察稳心颗粒对细胞内钙(Ca2+)-钙调蛋白(CaM)-钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)信号转导通路的干预作用，探讨其对心肌梗死大鼠模型心律失常的作用机制。研究结果表明：稳心颗粒治疗心力衰竭和心律失常的机制可能与其对CaMKⅡ信号转导通路的调节作用有关。结合本研究中稳心颗粒对细胞骨架蛋白的改善作用，对二者之间的作用途径，我们将进一步进行实验，对其进行验证。

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(本文编辑郭怀印)

The Influence of Wenxin Granule on the Cytoskeleton Protein in Ang Ⅱ Induced H9C2 Cell Hypertrophy Model

Ren Xiaomeng，Chen Yu，Li Jie，Wu Lijun，Yang Xinyu，Wu Aiming，Xing Yanwei，Shang Hongcai，Gao Yonghong

Key Laboratory of Chinese Interna Medicine of Ministry of Education and Beijing，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China；Guang’anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing，100053，China

Gao Yonghong (Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education and Beijing，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China)

Objective To study the effect of Wenxin granule (WXG)on the cytoskeleton protein of angiotensin Ⅱ(AngⅡ)induced H9C2 cell hypertrophy model. Methods H9C2 cells were cultured in vitro，the model of cardiomyocyte hypertrophy was induced by AngⅡ. After dosing WXG with 5 g/L， the morphological changes of the cells and the cytoskeleton were observe. Results The morphological of H9C2 cell induced by AngⅡhad changes，cell transverse tensile，swelling becomes larger，cell volume vs normal cells.After with the addition of WXG，H9C2 myocardial cell morphology had been restored，but still larger than the transverse width of normal cells. And the discovery of cell morphology were observed under confocal laser scanning microscopy (CLSM)，cell morphology was apparent swelling becomes larger，the length and the width of the cell respectively by 120.32 μm±8.36 μm and 51.82 μm±8.62 μm increased to 182.67 μm±7.81 μm and 92.22 μm±7.56 μm. After 24 hours of WXG， H9C2 myocardial cell morphology in AngⅡ group had been restored，the length and the width of the cell to 160.35 μm±5.66 μm，55.87 μm±4.52 μm. Conclusion In H9C2 cell model of hypertrophic myocardium induced by AngⅡ，the WXKL can improve the cytoskeletal protein，which plays a role in improving cardiac hypertrophy.

cardiac hypertrophy；H9C2 cells；angiotensin Ⅱ；Wenxin granule

国家自然基金(No.81373935，81430098)；北京中医药大学校级杰青项目(No.2015-JYB-XJQ001)

1.北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室和北京市重点实验室(北京100700)；2.福建卫生职业技术学院；3.中国中医科学院广安门医院

高永红，E-mail：gaoyh7088@163.com

R541.4 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.22.006

1672-1349(2016)22-2609-04

2016-08-02)

引用信息：任晓萌，陈钰，李洁，等.稳心颗粒对AngⅡ诱导H9C2细胞肥大模型骨架蛋白的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2016，14(22)：2609-2612.