血浆D-乳酸对非甾体抗炎药相关肠黏膜损害的早期诊断探讨

唐凯 周新妹 吴长明 陈群 陈涛 王彩平

血浆D-乳酸对非甾体抗炎药相关肠黏膜损害的早期诊断探讨

唐凯 周新妹 吴长明 陈群 陈涛 王彩平

目的探讨NSAIDs引起小肠黏膜损伤的机制，D-乳酸作为血浆标志物应用于NSAIDs肠黏膜损害的早期诊断价值。方法 雄性大鼠40只，对照组20只，对照组灌胃2 ml蒸馏水，2次/d；模型组阿司匹林片50mg/kg，2次/d，分T1（2d给药）和T2（7d给药）亚组，各10只。实验后进行小肠黏膜病理损伤评分；分析紧密连接Occludin蛋白的表达；同步测定血浆D-乳酸值。结果（1）模型组呈小肠黏膜损伤病理改变，T2亚组病理评分明显高于T1亚组（P＜0.01）。（2）Occludin/ GAPDH相对密度值模型组均较对照组明显降低（P＜0.01），T2亚组Occludin/GAPDH相对密度值显著低于T1亚组（t=7.646，P＜0.01）。（3）同步测定模型组血浆D-乳酸与对照组比较均明显升高（P＜0.01），T2亚组血浆D-乳酸较T1亚组明显升高（t=67.773，P＜0.01）。结论阿司匹林可导致大鼠小肠黏膜屏障破坏；测定血浆D-乳酸可以较早的反映NSAIDs引起的小肠黏膜损害。

血浆D-乳酸 非甾体抗炎药 Occludin蛋白 小肠损伤

非甾体类抗炎药（NSAIDs）具有良好的抗炎、解热和镇痛作用，广泛用于关节炎及缓解疼痛症状，在心脑血管病预防也是基础用药之一。临床重视NSAIDs引起的胃黏膜损害，而导致小肠溃疡、出血、穿孔、肠通透性升高的副作用的发生率高、风险大，近年逐渐受到临床关注［1］。2014年2月至2015年10月作者通过实验研究，探讨NSAIDs引起小肠黏膜损伤的机制，了解其病理生理变化，设立早期筛查指标，在发生肠并发症之前，能够为NSAIDs服用者提供一个便捷、可靠的非侵入性检查方法，达到防止严重并发症发生的目的。

1 材料和方法

1.1 实验材料 雄性SD大鼠40只，180～220g。由嘉兴医学院动物实验中心提供；阿司匹林肠溶片为德国拜耳制药公司产品，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 动物分组 采用随机抽签法，将40只大鼠随机分为2组，空白对照组20只，模型组20只，每组再进一步随机分为2d给药和7d给药亚组，各10只，模型组分别标注为T1亚组、T2亚组。

1.3 给药方法 对照组以2ml蒸馏水灌胃，2次/d；模型组以阿司匹林片50mg/kg灌胃，2次/d。2d给药对照组和T1亚组大鼠在灌胃2d后处死，7d给药对照组和T2亚组大鼠在灌胃7d后处死。

1.4 标本制作 大鼠禁食、不禁水12h，实验时采用10%水合氯醛3ml/kg剂量腹腔注射麻醉后处死；肉眼观测小肠黏膜标本损伤状况。取颈静脉血10ml，离心后取血浆分装，-80℃保存，用于D-乳酸的测定；在距回盲部25cm取小肠1cm，置10%甲醛液中固定，常规石蜡包埋切片，HE染色。

1.5 小肠黏膜上皮损伤程度组织病理评分 采用Chiu氏评分法分级［2］，O级：正常肠黏膜绒毛。Ⅰ级：肠黏膜绒毛顶端上皮下间隙增宽。Ⅱ级：中度固有层水肿，中央乳糜管扩张。Ⅲ级：肠黏膜上皮层细胞坏死，少数绒毛顶端脱落。Ⅳ级：部分绒毛脱落，固有层裸露，毛细血管充血。Ⅴ级：固有层崩解，出血或溃疡形成。

1.6 Occludin蛋白检测 过氧化物酶标记的链霉卵白素（SP）法检测Occludin蛋白，按照说明书进行SP三步法进行免疫组化染色，Occludin阳性呈棕黄色颗粒状，主要定位于小肠上皮细胞胞膜及胞质。WesternBlot检测Occludin蛋白表达：取各组大鼠小肠组织，加入组织裂解液，匀浆后离心，取上清液，测定蛋白含量；经过凝胶蛋白电泳，光化学法显色，拍片，以三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为内参照，利用QuantiScan凝胶图像扫描分析软件测定电泳条带的光密度值，计算Occludin与GAPDH光密度的比值。

1.7 血浆D-乳酸浓度测定（分光光度法） 按照试剂盒说明书操作，计算大鼠血浆D-乳酸浓度。

1.8 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件，计量资料以（x±s）表示，配对t检验，以P＜O.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小肠大体标本变化 对照组肠道黏膜光滑，肠管弹性好。T1亚组大鼠小肠黏膜可见散在浅表糜烂、溃疡；T2亚组大鼠肠黏膜见多发溃疡灶，部分有出血。

2.2 光镜下观察结果 对照组小肠黏膜无明显改变，绒毛完整无脱落。T1亚组肠绒毛肿胀、增粗、缩短，部分顶端破损；T2亚组小肠黏膜明显萎缩，固有层炎症细胞浸润，出现上皮细胞变性坏死、脱落，部分绒毛断裂、脱落，固有层裸露。模型组病理评分均高于对照组（P＜O.01），T2亚组病理评分明显高于T1亚组（P＜0.01），见图1、表1。

图1 各组大鼠小肠黏膜组织学表现（HE，×100）

表1 对照组和模型组大鼠小肠黏膜病理评分（x±s）

2.3 各组Occludin蛋白表达 经过免疫组化染色的病理切片显示，对照组小肠黏膜胞膜及胞质内见明显Occludin蛋白表达，表现为较多棕黄色细颗粒聚集；T1亚组及T2亚组较对照组均有减少，T2亚组减少更明显。肠黏膜紧密连接Occludin蛋白的表达：Occludin/ GAPDH相对密度值T1亚组（0.507±0.051）和T2亚组（0.644±0.026）均较对照组（1.264±0.016）明显降低（P＜0.01），T2亚组Occludin/GAPDH对密度值显著低于T1组（t=7.646，P＜0.01），见图2～4。

图2 各组大鼠小肠黏膜上皮细胞Occludin蛋白表达

图3 各组大鼠肠黏膜Occludin蛋白电泳结果（Western blot法）

2.4 血浆D乳酸检测结果T1、T2亚组血浆D乳酸与对照组比较均明显升高（P＜0.01），T2亚组血浆D乳酸较T1亚组明显升高（t=67.773，P＜0.01），差异均有统计学意义。见表2。

表2 分组大鼠D-乳酸值比较（x±s）

图4 各组大鼠肠上皮紧密连接occludin蛋白表达的不同

3 讨论

NSAIDs是具镇痛及抗炎作用的药物，广泛应用于各种急慢性疼痛及风湿性心血管类疾病，每年大约有20万使用NSAIDs患者出现并发症，病死率＞10%［3］。既往对NSAIDs的消化道损伤重点多关注在胃黏膜，但NSAIDs引起的肠道副作用的发生率高、风险大，近年逐渐受到临床关注；NSAIDs所致的小肠黏膜早期病变多数为表浅性小溃疡，溃疡面与周围黏膜界限清晰［4］，还可出现小肠出血、蛋白质丢失性肠病、肠通透性升高及穿孔等，统称为NSAIDs相关性肠病。本资料中参照成人用阿司匹林剂量作用大鼠肠道，结果大鼠小肠黏膜有不同程度的糜烂、溃疡等病变发生，光镜下也有相应的病理改变。

目前NSAIDs导致肠道损害的可能机制中，炎性反应起关键作用，通过抑制环氧合酶活性过程中增加白三烯的生成，促进组胺、自由基释放，造成肠道黏膜损伤［5］；肠道屏障破坏，通透性增加使小肠细胞暴露在胆汁、消化酶及细菌机会明显增加，导致肠黏膜损伤［6］。肠黏膜机械屏障由肠道黏液层、上皮细胞、细胞间紧密连接等构成，是阻止致病物质入侵及细菌移位的屏障系统［7］，其功能的发挥需要完整的上皮细胞屏障，Occludin作为一种整体膜蛋白，是细胞间紧密连接的重要组成部分，对维持肠道上皮屏障的完整至关重要［8］。本资料中对照组大鼠小肠上皮Occludin蛋白密集表达，T1亚组及T2亚组较对照组分布均有减少，T2亚组减少更明显；Occludin/ GAPDH相对密度值模型组均较对照组明显降低（P＜0.01），T2亚组Occludin /GAPDH相对密度值显著低于T1组（P＜0.01）。提示模型组大鼠肠道黏膜机械屏障遭到破坏，随病程延长破坏加重。

在此实验，肠黏膜屏障状况采用了新的血浆标志物D-乳酸定量测评。一般认为，D-乳酸是细菌代谢产物，肠道中多种细菌均可产生；当肠黏膜屏障受损，肠道细菌产生的D-乳酸通过受损黏膜入血循环，哺乳动物缺乏D-乳酸脱氢酶，当肠黏膜受损早期、肠黏膜通透性增加时，血中可检测到D-乳酸水平升高［9］。本资料中，T2亚组光镜下肠黏膜受损更明显，同步检测D-乳酸水平较T1亚组明显升高，表明D-乳酸测定较好的反映大鼠肠黏膜的受损状况，T1亚组较对照组D-乳酸显著升高，可早期提示大鼠肠黏膜的损害，表明血浆D-乳酸水平变化与NSAIDs引起的小肠黏膜进行性受损相关。因此，通过静脉血检测D-乳酸水平可反映NSAIDs所致肠黏膜损害的程度。

总之，NSAIDs可导致肠黏膜破坏，体循环D-乳酸水平相应升高，其含量与小肠黏膜损害相关。因此，D-乳酸可作为血浆标志物应用于NSAIDs肠黏膜损害的早期诊断。对于长期服用NSAIDs的患者，可进行血检测D-乳酸筛查，发现数值升高者，再考虑安排侵入性的内镜检查。NSAID的小肠损害机制尚不明确，本资料中大鼠肠黏膜occludin蛋白表达减少，反映肠道屏障的破坏是机制之一，其他途径尚需进一步研究。

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ObjectiveTo study the mechanism of NSAIDs induced intestinal mucosal injury，and the early diagnosis of D-lactate as a marker of NSAIDs in the early diagnosis of intestinal mucosal damage.Methods40 male rats，the control group of 20，the control to fi ll the stomach 2 ml distilled water twice a day；Model group aspirin 50 mg/Kg twice a day，points T1（2 day delivery）and T2 for 7 days（medicine）subgroups，10 each. After the experiment of small intestinal mucosa pathological damage score；analyze the changes of Occludin protein localizing at tight junction of intestinal epithelial cells；Simultaneous determination of D-lactate in plasma.ResultsIn the model group，the pathological changes of intestinal mucosa injury，the pathological score of T2 subgroup was signifi cantly higher than that in T1（P＜0.01）；（2）The relative density of Occludin/ GAPDH was signifi cantly lower than that in control group（P＜0.01），and the relative density of Occludin/GAPDH in T2 subgroup was signifi cantly lower than that in T1（t=7.646，P＜0.01）；（3）In the model group，the plasma D-lactate was signifi cantly higher than that in the control group（P＜0.01），and the D-lactate in the T2 subgroup was signifi cantly higher than that in the T1（t=67.773，P＜0.01）.ConclusionAspirin can cause intestinal mucosal barrier damage in rats；the plasma D-lactate can refl ect the NSAIDs induced intestinal mucosal lesion in the early.

The Plasma D-lactate NSAIDs Occludin Protein Intestinal Damage

浙江省嘉兴市科技计划项目（2014AY21035-3）

314000 浙江省荣军医院（唐凯 吴长明 陈群 陈涛王彩平）

314000 浙江省嘉兴学院医学院（周新妹）