动脉自旋标记技术在针刺fMRI研究中的可行性分析

卢琦，武红利，王安琴，汪林英，徐春生，汤岚凤，李传富

（1.安徽中医药大学研究生部，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院影像中心，安徽 合肥 230031）

动脉自旋标记技术在针刺fMRI研究中的可行性分析

卢琦1，2，武红利1，王安琴1，汪林英2，徐春生2，汤岚凤1，李传富2

（1.安徽中医药大学研究生部，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院影像中心，安徽 合肥 230031）

目的：探讨基于动脉自旋标记（arterial spin labeling imaging，ASL）灌注成像技术在fMRI针刺作用机制研究的可行性。方法：选取健康志愿者40例，根据扫描技术方法的不同分为ASL组与BOLD组，每组各20例（男女各10例）；采用相同的改良组块设计方案，并由相同的针灸医师针刺，分别对2组数据进行处理确定脑功能激活区，比较2组研究对象激活区的异同，并对ASL组激活区区域性脑血流量（regional cerebral brain，rCBF）变化幅度及变化率进行统计学分析。结果：ASL组除了显示BOLD组的体感相关脑区（双侧SⅡ、岛叶、丘脑及中扣带回）及运动相关脑区（SMA）激活之外，还在SⅠ、额叶、顶下小叶、前扣带回等脑区显示激活，但较BOLD组相对多见的脑白质区域激活显著减少，同时ASL组信号变化幅度较大，rCBF变化率为（9.21± 2.82）%。结论：针刺引起的ASL信号变化幅度更大，能够敏感地检出针刺引起的大脑激活区，且伪影很少。同时，基于ASL技术的针刺fMRI研究不受针刺方案限制，更加符合临床针刺fMRI研究的需要，值得推荐使用。

自旋标记；针刺；脑功能成像；足三里

针刺作为中国传统医学的一种重要治疗手段，其替代和补充干预治疗效果显著［1］，但其现代中枢作用机制尚不明确且有争议［2］。传统基于BOLD技术的针刺fMRI研究由于采集的针刺信号较弱（针刺刺激引起的BOLD信号变化幅度一般不超过1%［3］）、背景噪声大、受实验刺激方案本身可能带来的习惯化效应及采用的算法等多种因素影响，成像数据稳定性、可重复性差［4-6］。同时，实验中针刺刺激方案设计多采用单个或数个穴位取穴的相对规则的组块设计，不同于临床实践的针刺治疗方案，数据分析结果存在局限性。

动脉自旋标记（arterial spin labeling imaging， ASL）技术是一种无需外源性对比剂，通过标记自体动脉血质子无创获得脑血流量（cerebral brain flow，CBF）信息的灌注成像技术，其定量测量的区域性脑血流量（regional cerebral brain flow，rCBF）是定量分析脑血流的重要指标，具有明确的临床及生理学意义。同时，ASL技术能够真实模拟临床治疗过程，不受实验方案限制，且数据处理较BOLD简单，是临床工作中认可度较高的常用检查技术。本研究通过对比分析基于ASL与BOLD 2种反映大脑血流量变化的检查技术对针刺健康人左侧足三里穴脑激活区的异同，以探讨ASL技术在fMRI针刺作用机制研究中的可行性。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取安徽中医药大学第一附属医院实习医学生、医院职工作为被试志愿者，均无精神或神经系统疾病及相关药物服用史，且为右利手，分为ASL组及BOLD组各20例（男女各10例）。ASL组年龄23～30岁，平均（25.55±2.16）岁；BOLD组年龄20～29岁，平均（24.60±2.58）岁。将内容告知被试者，并自愿签署知情同意书。

1.2 仪器与方法

1.2.1 仪器实验在安徽中医药大学第一附属医院影像中心MRI室完成。使用GE MR750 3.0 T超导型MRI扫描机和标准头部线圈进行扫描。依次扫描7个序列：①定位像。②匀场序列。③T2WI，取与前后联合连线（AC-PC线平行的横轴位），共20层，用于除外脑内有无病变及发育变异。④T1WI 3D解剖像，取矢状位，共扫描166层，扫描范围覆盖全脑，采用扰相位梯度回波序列，TR 8.2 ms，TE 3.2 ms，TI 450 ms，FOV 256mm×256mm，层厚1mm，分辨率256×256。⑤针刺前ASL（针刺前静息BOLD），扫描方位同T2WI序列；ASL序列采用3D-pcASL序列，共36层，TR 4 632 ms，TE 10.5 ms，SL 4 mm，FOV 240 mm× 240 mm，分辨率128×128，标记延时1 525 ms；BOLD采用EPI BOLD序列，共36层，TR 2 000 ms，TE 35ms，FA 90°，层厚3mm，层距1mm，FOV 240mm× 240 mm，分辨率64×64。⑥针刺中ASL（针刺中BOLD），扫描方位及序列同针刺前。⑦针刺后ASL（针刺后静息BOLD），扫描方位及序列同针刺前。完成一例数据采集约需20 min 53 s（BOLD组20 min 56 s）。

1.2.2 实验步骤与设计志愿者更衣休息30 min，全身放松后，进入扫描室。嘱其平躺，闭眼，用3M1100防噪声弹性耳塞塞耳，固定头部，关闭通话系统，减少除系统噪音外其他声音的刺激。扫描过程中，全身尤其是头部保持静止，放松心情尽量避免心理活动。用一次性无菌不锈钢毫针（天协牌，直径0.35mm，长40 mm）针刺被试者左侧足三里穴；采用捻针和留针（非捻针）2种手法，捻针用平补平泻法，左右捻针，频率1 Hz，进针深度2.5 cm。2组针刺由同一名工作经验丰富的针灸医师完成，并详细询问、记录每一例被试者的针刺感觉。ASL组与BOLD组针刺刺激方案均采用相同的改良组块设计，即“基线-任务刺激”的OFF-ON模式，采用静息状态（留针）与刺激状态（捻针）交互进行的方式，针刺刺激序列扫描开始之前进针，然后开始扫描采集fMRI数据，先静息54 s，然后行捻针刺激54 s，再静息留针81 s，再捻针刺激54 s，最后ASL组与BOLD组分别静息留针为26 s、27 s，功能像采集共持续4 min 29 s（ASL组）、4 min 30 s（BOLD组）。实验设计方案见图1。

图1 实验设计模式示意图

1.3 数据处理所有实验数据在安徽中医药大学第一附属医院数字化影像技术实验室处理（国家中医药管理局三级实验室，编号TCM-2009-196）；本次实验主要探讨ASL技术在针刺fMRI研究中的可行性，数据处理仅涉及ASL组与BOLD组的针刺前与针刺中fMRI数据。

1.3.1 ASL数据处理方法与步骤采用功能成像分析（analysis of functional neuroimaging，AFNI）软件，处理步骤：①数据格式转换，将医学数字成像与通讯（DICOM）格式的图像文件转换为AFNI数据处理需要的nii格式。②将解剖像与功能像对齐并去除功能像周围噪声。③数据平滑，采用半高全宽（FWHM）为5 mm高斯函数进行滤波，对数据进行平滑化处理。④空间标准化，为消除每个个体大脑的解剖差异，将个体参数图从原始的坐标系转换为标准的TT坐标系。⑤采用双样本t检验计算出针刺中数据与针刺前数据的脑激活区差异。⑥阈值校正，采用Monte Carlo模拟校正方法，选择P=0.001，计算出α≤0.05的最小Cluster Size Voxels（176个体素），并从参数图中提取coef值转变为Z值，计算激活脑区rCBF变化幅度与变化率。

1.3.2 BOLD数据处理方法与步骤同样采用AFNI软件，处理步骤：①预处理。a.数据格式转换，将DICOM格式的图像文件转换为nii格式；b.对解剖数据集功能数据进行去倾斜校正；c.去头皮处理、去除原始功能像数据的前4个时间点以避免扫描开始之初不稳定因素的影响；d.去除线性漂移以消除机器造成的干扰；e.头动校正，将剩余的时间点数据与第1个时间点数据对齐，剔除扫描过程中头动范围超过2mm或2°的数据；f.数据平滑，采用FWHM为5 mm高斯函数进行滤波，对数据进行平滑化处理；g.数据标准化，为消除不同个体或同一个体不同次扫描数据之间的全局漂移，对数据进行标准化，使得不同数据平均值相同；h.获取每个个体的全脑掩膜，并用生成的mask数据集与平滑后的数据进行配对计算。②计算个体统计参数图。利用AFNI程序的反卷积计算每个个体的统计参数图，并将功能数据与解剖数据项对齐。③空间标准化。为消除每个个体大脑的解剖差异，将个体参数图从原始的坐标系转换为标准的TT坐标系。④单样本t检验。计算所有数据的脑功能活动区，然后将剩余的所有有效研究数据的统计参数图转换到的Talairach标准空间，采用单样本t检验计算出研究数据的脑功能活动区。⑤阈值校正。选用全脑模板，采用Monte Carlo模拟校正方法，选择P=0.001，计算出α≤0.05的最小Cluster Size Voxels（176个体素），并从参数图中提取coef值转变为Z值。通过阈值校正后，统计并记录激活区的位置、信号类型、位置坐标系Z值。

2 结果

2.1 针刺左侧足三里穴ASL组结果脑内多处功能区被激活，均为信号升高区域。除体感相关脑区（双侧SⅡ、岛叶、丘脑及中扣带回）以及运动相关脑区（SMA）显示激活之外，还在SⅠ、额叶、顶下小叶、前扣带回、桥脑等脑区及尾状核头、红核等灰质核团显示激活，右侧颞枕交界处白质区亦见激活区（表1，图2，3）。脑激活区rCBF变化幅度平均5.566± 1.219，变化率平均（9.212%±2.818）%（表2）。

表1 针刺左侧足三里穴动脉自旋标记（ASL）组脑内激活区分布

2.2 针刺左侧足三里穴BOLD组结果脑内多处功能区被激活（表3），信号升高区域包括体感相关脑区（双侧SⅡ、岛叶、丘脑及中扣带回）以及运动相关脑区（SMA），右侧额中回及邻近白质亦存在正激活；信号减低区域包括右侧中央后回，右侧枕中回及白质、右侧颞中回及白质，左侧舌叶及邻近白质、左侧海马旁回及左侧脑室、左侧角回及邻近白质（图2，3）。

3 讨论

3.1 ASL技术应用于fMRI针刺研究的可行性尽管近年来基于BOLD技术的针刺fMRI研究，受到实验方案设计、数据采集、数据处理等多方面因素影响，其研究报告的激活区结果不尽相同，甚至差异性较大［6］，但大多学者［7-10］普遍认为针刺作为一种体感刺激，包括丘脑、SⅠ、SⅡ、岛叶及顶下小叶在内的体感区域的激活是足三里穴的公认针刺激活区［7-10］。本实验中2种方法的共同激活区基本上与体感信息处理相关脑区一致，能够获得更多且更加稳定的脑激活区，且脑白质区域的伪影显著减少，针刺引起的rCBF信号变化率更大，说明基于ASL技术的fMRI研究具有可行性，且敏感性和稳定性更高。

3.2 ASL技术应用于fMRI针刺研究具有更高敏感性本研究中，针刺左侧足三里穴BOLD组除了体感相关脑区（双侧丘脑、双侧SⅡ、双侧岛叶、中扣带回）及运动相关脑区（右侧额叶内侧回）的激活，其他脑激活区很少（右侧额中回），而ASL-fMRI激活区则较为广泛，除上述BOLD组体感相关及运动相关脑区激活外，在额叶、顶下小叶和前扣带回等脑区，以及与针刺穴位对应的SⅠ和与疼痛信息处理相关的脑干区域存在广泛激活。

ASL组较BOLD组增多的激活区：与运动相关，包括行动好坏的选择及不适宜行为的抑制等的额叶大脑皮层（左侧额中回、左侧额下回、右侧额上回、右侧额下回）；与感觉信息理解相关的顶下小叶（双侧顶下小叶）；与受到刺激的情绪反应调节相关的前扣带回皮层。通过对上述激活脑区的生理学功能分析，推测这些脑区的激活可能是人体对针刺疼痛刺激的一种反应［11-13］，针刺过程中这些区域的激活也是针刺fMRI研究报道最多的脑区。

表2 针刺左侧足三里穴ASL组信号变化（±s）

表2 针刺左侧足三里穴ASL组信号变化（±s）

注：ASL：动脉自旋标记；rCBF：区域性脑血流量。

激活区域针刺前针刺后rCBF值变化幅度［mL·min·（100 g）-1］rCBF值变化率（%）双侧前、中扣带回73.392±9.05479.878±9.9656.486±3.1759.272±4.398左侧岛叶、眶上回63.173±7.93268.191±9.0445.018±3.1518.241±5.267右侧岛叶、SⅡ67.733±8.21072.942±9.0765.209±2.7717.962±4.028左侧顶下小叶65.604±8.19871.585±9.6435.981±3.2839.441±5.090双侧丘脑、右侧红核、桥脑左侧61.946±8.82766.967±9.1585.021±2.8238.537±4.499左侧额中回、额下回59.778±8.98264.517±8.9924.739±2.9828.673±5.945右侧前扣带回、左侧额内侧回（SMA）87.413±10.80692.238±10.8994.826±2.7745.773±3.322右侧SⅠ42.630±9.95649.859±9.9527.229±4.95620.03±13.896左侧SⅡ74.400±9.89080.756±11.2726.355±4.0718.674±5.686左侧额下回71.909±12.10376.539±11.9954.629±3.2356.785±4.968右侧顶下小叶72.058±9.23377.633±10.4105.575±4.0667.835±5.752双侧额内侧回（SMA）76.833±10.71282.800±12.4085.967±4.9198.122±6.868右侧额下回77.929±12.32783.253±14.0785.324±4.0326.773±5.183右侧额内侧回（SMA）86.568±15.63993.489±16.0976.920±5.4258.516±7.238右侧岛叶64.195±7.80970.674±10.6946.479±5.66010.036±8.349右侧颞枕交界白质区34.106±6.02436.810±6.2582.704±1.6848.586±5.813右侧尾状核头45.225±6.74049.053±5.8853.827±3.1099.269±7.908右侧眶中回63.841±12.85669.362±12.9175.522±4.3669.437±7.872右侧中扣带回77.141±10.49981.942±10.3884.801±3.8916.564±5.086右侧海马旁回55.690±6.85160.231±7.2424.541±3.6798.537±6.619左侧眶中回66.447±11.38073.470±11.8397.023±5.15111.609±8.821右侧眶中回72.891±11.04781.208±11.2828.316±6.55112.352±10.282右侧额上回56.089±8.27161.605±7.7745.516±4.64210.843±10.996合计65.956±13.11471.522±13.6415.566±1.2199.212±2.818

表3 针刺左侧足三里穴BOLD组脑内激活区分布

作为SⅠ的中央后回，理论上也是体感刺激应该激活的脑区之一［9，14-15］。但由于感觉信息投射SⅠ的比例较低（4%）［10］且针刺引起BOLD信号变化幅度很小（1%）［3］，基于BOLD技术的针刺fMRI研究报道相对较少。本实验中，基于BOLD的fMRI研究组同样未在SⅠ区发现激活区，但在基于ASL技术的fMRI研究组中在SⅠ区域（右侧中央后回）存在明显的正激活，且与针刺位置（左侧足三里穴）的皮层感觉投射位置相对应。

ASL-fMRI组在红核、桥脑及其周围网状结构存在正激活。既往常规BOLD-fMRI针刺研究中关于脑干神经核团激活的报道很少，Zyloney等［17］采用特殊扫描技术报道了针刺BOLD-fMRI中脑干神经核团的激活。而基于ASL的fMRI无需特殊扫描模式即可显示脑干内的激活区。脑干区域富含大量神经核团，可能与针刺镇痛的作用机制相关［11，18-19］，因此这一区域结构激活的显示尤为重要。

图2 ASL组与BOLD组分析结果横轴位（P=0.001，α≤0.05，cl=176）图2a，2b分别为ASL组（18例）和BOLD组（20例）分析结果。ASL组除了显示BOLD组的体感相关脑区（双侧SⅡ、岛叶、丘脑及中扣带回）以及运动相关脑区（SMA）激活之外，还在SⅠ、额叶、顶下小叶、前扣带回等脑区显示激活，但较BOLD组相对多见的脑白质区域激活显著减少

图3 ASL组与BOLD组分析结果SUMA图（P=0.001，α≤0.05，cl=176）图3a，3b分别为ASL组和BOLD组分析结果。SI：主要感觉区；SⅡ：辅助感觉区；SMA：补充运动区；ACC：前扣带回；MCC：中扣带回；ns：岛叶；Thal：丘脑；SOG：眶上回；RN：红核；IPL：顶下小叶；MFG：额中回；IFG：额下回

上述ASL组除了显示BOLD组的体感相关脑区及运动相关脑区激活之外，还在SⅠ、额叶、顶下小叶、前扣带回等脑区显示更广泛激活，表明ASL-fMRI即使在较高的P值检验下（P=0.001），同样能够得到针刺足三里穴相应的脑激活区，较BOLD具有更高的敏感性。

3.3ASL技术应用于fMRI针刺研究具有更高稳定性本研究发现：针刺左侧足三里穴ASL组引起的激活区信号变化幅度（rCBF变化幅度）平均值为5.566±1.219，激活区信号变化率（rCBF变化率）平均为（9.212±2.818）%，明显高于文献报道［3］的BOLD信号小于1%的变化率。同时，基于BOLD的fMRI研究其时间序列信号受到基线不稳、系统噪声影响SNR较低。本实验的2组数据，采用全脑模板进行较为宽松的Monte Carlo校正方法（P=0.001，α≤0.05），BOLD-fMRI组共有8个激活区，虽激活程度较高，激活区范围较大，但主体位于白质区域，伪影可能性大（右侧额中回及邻近白质、左侧内囊的正激活及右侧中央后回；右侧枕中回及白质、右侧颞中回及白质、左侧舌叶及邻近白质、左侧海马旁回及左侧脑室、左侧角回及邻近白质的负激活），即使进行较为严格的FDR校正（P=0.001，α≤0.05），BOLD组仍不能消除所有伪影（右侧中央后回、右侧枕中回及白质、右侧颞中回及白质的负激活）。而ASL-fMRI组仅1个（位于右侧颞枕交界处白质区的正激活），FDR校正后消失。ASL组激活区信号的变化幅度更大、图像SNR更高，能够敏感地检出针刺引起的大脑激活区，且伪影发生率很小，说明ASL技术相比BOLD在针刺fMRI研究中具有更高的稳定性。

综上所述，针刺ASL-fMRL研究具有高敏感性和高稳定性、伪影少、不受针刺刺激方案影响及数据后处理方法简单等优势，并且通过ASL-fMRL针刺任务态和静息态的rCBF值对比分析，可得到大脑对针刺响应的即刻效应，有利于研究针刺作用的整体及长期效应，更加符合临床针刺fMRI研究的需求，值得推荐使用。但ASL技术由于时间分辨力较BOLD低，无法进行静息态功能连接分析，且可能会受到标记延时时间影响，应与BOLD在fMIR研究中互为补充。本实验中，由于为了和前期BOLD-fMRI数据采集条件大致匹配，ASL序列设计采用较短的扫描时间，并同时采用了不规则改良组块设计模式，ASL与BOLD分辨力没有完全统一，在一定程度上影响了结果的精准性，有待进一步改进。

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Feasibility of applying arterial spin labeling to the study of acupuncture fMRI

LU Qi，WU Hongli，WANG Anqin，WANG Linying，XU Chunsheng，TANG Lanfeng，LI Chuanfu.Anhui University of Chinese Medicine，Anhui，230038，China.

Objective：To investigate the feasibility of applying ASL perfusion imaging technology to the study of the mechanism of acupuncture.Methods：Forty right-handed healthy adult volunteers were recruited for this study.According to scanning method，the subjects were divided into two groups，i.e.ASL and BOLD group.Each group had 20 cases（male 10 cases，female 10 cases）、A modified block design was used in the acupuncture stimulation.Manual acupuncture stimulation was performed by the same acupuncturist at left ST36.The activated brain areas induced by acupuncture were analyzed and compared between the two groups in order to find their similar activations and different ones.The rCBF signal change was calculated and compared with the BOLD signal change reported in published papers.Results：While some common activation in the somatosensory related cortex and motor related cortex were demonstrated in both group，more activations，including the SI，the frontal lobe，inferior parietal lobule，anterior cingulate cortex were found in the ASL group.At the same time，activations in the areas of white matter，which were most probably false discovery，were significantly decreased in the ASL group.Furthermore，the degree of ASL signal change in the ASL group，which was（9.21±2.82）percent，was much higher than that of BOLD group.Conclusion：The ASL signal change induced by acupuncture stimulation is higher than the BOLD signal change.Therefore，it is more sensitive and robust.At the same time，the ASL-based fMRI is not confined by the paradigm of acupuncture stimulation and favorable to clinical acupuncture research.

ASL；Acupuncture；Brain functional imaging；Zusanli

2015-10-21）

10.3969/j.issn.1672-0512.2016.02.002

国家自然科学基金项目（81202768）；安徽中医学院青年科学临床基金（2011qn022）。

李传富，E-mail：13956078816@126.com。