NLRP3/Caspase-1炎性体通路在临床慢性根尖周炎病变组织中的表达

王丽娜，叶丹丹，王娇娇，敖 翔，刘启成，牛卫东

(大连医科大学 口腔内科教研室，辽宁 大连 116044)

论 著 doi:10.11724/jdmu.2016.06.04

NLRP3/Caspase-1炎性体通路在临床慢性根尖周炎病变组织中的表达

王丽娜，叶丹丹，王娇娇，敖 翔，刘启成，牛卫东

(大连医科大学 口腔内科教研室，辽宁 大连 116044)

目的 探讨临床慢性根尖周炎病变组织中NLRP3/Caspase-1炎性体通路的表达情况。方法 收集2013年10月至2014年4月在大连医科大学附属口腔医院就诊的因慢性根尖周病需行根尖外科手术治疗或需拔牙的患者20例，取患者牙周组织作为根尖周炎病组；正畸治疗需要拔除的健康恒牙患者，搔刮拔除后的牙齿根尖周组织，作为对照组。通过Real-time qPCR及免疫组织化学的方法检测NLRP3、Caspase-1、 IL-β mRNA及蛋白的表达情况，并对NLRP3、Caspase-1、 IL-β的蛋白表达进行相关性分析。结果 NLRP3、Caspase-1及IL-1β在根尖周炎病组中的mRNA及蛋白表达量均明显高于对照组，差异有显著性意义(P<0.05)。根尖周炎病组织内NLRP3、Caspase-1、 IL-β阳性细胞主要位于中性粒细胞、淋巴细胞及浆细胞中，其中NLRP3、Caspase-1主要表达于胞浆，IL-1β可表达于胞浆与胞核。相关性分析结果显示，NLRP3与Caspase-1的表达存在着中度相关性，r=0.733；IL-1β与NLRP3及Caspase-1的表达存在着低度相关性，r=0.378及r=0.341，P均<0.05。结论 NLRP3炎性体在人的慢性根尖周炎症中表达增高。

慢性根尖周炎；NLRP3；Caspase-1

根尖周病是一种以细菌感染为主的免疫炎症反应，若不经过完善的牙髓治疗，已经遭受损伤的根尖周组织是不能恢复正常的。NLRP3炎症小体(inflammasome)通路可识别包括细菌在内的多种病原体，在机体抵御病原微生物的第一道防线中发挥关键作用[1-4]。在受到外界刺激后，NLRP3通过寡聚化聚集大量的Pro-Caspase-1，从而形成NLRP3炎性体并促使Caspase-1 活化，进而在天然免疫防御中促进Pro-IL-1β的切割成熟释放IL-1β，其中IL-1β是NLRP3炎症体活化的标志[5-6]。有研究表明，相较于可逆性牙髓炎，在不可逆性牙髓炎中，NLRP3/Caspase-1表达明显增高[7]，但NLRP3炎性体在临床根尖周炎症中的表达目前尚鲜见报道。

本研究收集临床根管治疗失败需根尖手术或拔牙治疗的慢性根尖周炎(包括根尖周肉芽肿、根尖周囊肿)的病变组织，采用Real-time qPCR方法及免疫组织化学方法检测NLRP3、Caspase-1及IL-1β的表达情况，探讨NLRP3炎性体在慢性根尖周炎症中的表达情况。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

兔抗人Caspase-1抗体、兔抗人IL-1β抗体(巴傲得生物科技有限公司)，兔抗人NLRP3多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，DAB显色剂和SP试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验对象

收集2013年10月至2014年4月在大连医科大学附属口腔医院就诊的因慢性根尖周病需行根尖外科手术治疗或需拔牙的患者20例。其中男9例，女11例，年龄18～56岁。取患者牙周组织作为根尖周炎病组。选取同期正畸治疗需要拔除的健康恒牙患者10例，女4例，男6例，年龄为15～40岁。搔刮拔除后的牙齿根尖周组织，作为对照组。

根尖周炎病组排除患有严重牙周病，因牙周牙髓联合病变所致根尖周脓肿或囊肿病例需根尖外科手术或拔除的患者。所有患者均无系统疾病，且1个月内没有服用过抗生素，组织获取顺利。经患者知情同意签字，由大连医科大学伦理学委员会批准后进行实验。

1.2.2 临床样本采集与处理

实验收集的样本放置于-80 ℃冰箱中保存，用于免疫组织化学染色的病变组织在流水下冲洗去掉血液用生理盐水漂洗后，置入4%多聚甲醛中固定2 d后进行免疫组织化学实验。

1.2.3 Real-time qPCR 实验

按照上海生工生物工程股份有限公司的UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒说明书进行组织总RNA提取，依据PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser(TaKaRa)说明书去除基因组DNA及进行反转录反应。按照SYBR(r) Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)进行Real-time qPCR实验。表1中为人NLRP3，Caspase-1，IL-1β及内参基因GAPDH的引物序列，引物委托上海生工生物工程股份有限公司设计并合成。根据荧光信号，收集实验数据，测定各样品目的基因和内参基因的ct值。本实验采用2-△△Ct法来确定目的NLRP3炎性体基因表达相对量。每个样本重复3次，取均值。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.4 免疫组织化学实验

组织块固定后进行石蜡包埋，石蜡切片机切片，制作平行于牙根长轴矢状面的连续切片，切片厚度为5 μm。石蜡切片常规烤片脱蜡至水后PBST漂洗，行抗原修复。玻片冷却后依据过氧化物酶标记的链霉卵白素(Streptavidin/Peroxidase)染色试剂盒的说明书进行免疫组织化学染色，其中兔抗人NLRP3特异性抗体稀释倍数为1∶100，兔抗人Caspase-1多克隆抗体、兔抗人IL-1β多克隆抗体稀释倍数为1∶50。

免疫组化实验结束后用OLYMPUS (BX-43) 光学显微镜镜下观察并拍摄照片，在高倍镜(×400)下计数病变区域NLRP3、Caspase-1、IL-1β阳性细胞数(单位：个/3×104μm2)，每个组织随机选取3张非连续切片。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 NLRP3、Caspase-1、 IL-β mRNA的表达情况

根尖周炎病组NLRP3的相对表达量均数为2.21，Caspase-1为2.63，而IL-1β则高达4.8，均明显高于正常对照组，差异有显著性意义(P<0.05)。见图1。根尖周炎病组中根尖周肉芽肿与根尖周囊肿病例中，NLRP3、Caspase-1、 IL-β mRNA的表达量无明显差异(P>0.05)。

图1 NLRP3、Caspase-1、 IL-β mRNA的表达情况Fig 1 Expression of NLRP3,Caspase-1, IL-β in mRNA level*与对照组比较， P<0.05

2.2 NLRP3、Caspase-1、 IL-β 蛋白的表达情况及相关性分析

免疫组织化学实验结果中，根尖周炎病组NLRP3、Caspase-1及IL-1β均呈阳性表达，组织内可见明显的深染棕黄色阳性细胞，阳性细胞主要位于中性粒细胞、淋巴细胞及浆细胞中，其中NLRP3、Caspase-1主要表达于胞浆，IL-1β可表达于胞浆与胞核。而在正常根尖周组织中，NLRP3、Caspase-1偶有表达，IL-1β有少量表达。统计学分析显示，根尖周炎病组NLRP3、Caspase-1及IL-1β的表达均明显高于正常对照组，差异有显著性意义(P<0.05)。根尖周炎病组中根尖周肉芽肿与根尖周囊肿病例的NLRP3、Caspase-1及IL-1β蛋白表达无差异(P>0.05)。见图2。

相关性分析结果显示，NLRP3与Caspase-1的表达存在着中度相关性，r=0.733；IL-1β与NLRP3及Caspase-1的表达存在着低度相关性，r=0.378及r=0.341，P均<0.05。见图2。

图2 NLRP3、Caspase-1、 IL-β蛋白的表达情况及相关性分析Fig 2 Expression of NLRP3，Caspase-1， IL-β in protein level and correlation analysisA：NLRP3、Caspase-1、IL-1β的免疫组化结果(×400)，红色箭头所指褐色或棕黄色深染的胞浆胞核即为阳性细胞; B：NLRP3、Caspase-1、IL-1β表达情况的统计学分析，*与对照组比较，P<0.05; C：NLRP3与Caspase-1、NLRP3与IL-1β、Caspase-1与IL-1β相关性分析散点图

3 讨 论

慢性根尖周炎虽无明显的疼痛，但其最重要的损害是伴牙槽骨破坏。患者如得到彻底及时的治疗，损害可以被修复，否则病变将表现为根尖周肉芽肿、根尖周囊肿[8-10]。在临床上，根尖周肉芽肿和根尖周囊肿病例常在根管治疗后行根尖外科手术切除，达到彻底治愈的目的，而有些严重病例则需要拔牙。故本部分研究选用根尖周肉芽肿或根尖周囊肿，这样较容易获得样本。

目前关于NLRP3炎性体的研究主要集中于慢性炎症和自身免疫性疾病，在牙髓根尖周病方面的研究主要有集中在牙髓炎症方面。在正常的牙髓组织中，有大量的NLRP3炎性体的存在，而牙髓成纤维细胞作为牙髓组织内的主要细胞，也可以表达NLRP3[11]。进一步研究发现，当人牙髓成纤维细胞(human dental pulp fibroblasts，HDPFs)受到变异链球菌和ATP的共同刺激后，NLRP3、Caspase-1、P2X7、IL-1β的mRNA及蛋白的表达均明显高于正常对照组[7]。当HDPFs受到LPS及ATP共同作用， NLRP3炎性体及IL-1β的表达明显升高，说明IL-1β的活化与NLRP3炎性体的激活密切相关[12]。

本研究的结果显示，与正常根尖周组织的样本相比，NLRP3、Caspase-1及IL-1β在根尖周肉芽肿和根尖周囊肿中的表达无明显区别。根尖周囊肿与根尖周肉芽肿主要的区别是根尖周囊肿是由Malassez上皮参与其中，囊液中含有胆固醇结晶等成分；除此之外，二者均伴有炎症性的骨破坏。说明NLRP3炎性体可能更重要的是参与了根尖周组织的炎症反应及骨破坏，主要表现为在炎症区及骨吸收区炎性体的表达明显升高，亦有研究报道在大鼠根尖周炎中，NLRP3炎性体相关因子的表达随着根尖周炎症反应及骨吸收的加重而增加[13]，但其促炎反应的具体机制仍有待进一步研究。

相关性分析结果显示NLRP3和Caspase-1的表达有中度相关性，而IL-1β与NLRP3及Caspase-1的表达为低度相关，其中原因是多方面的。虽然外界刺激可以激活NLRP3，进而激活Pro-Caspase-1，成熟的Caspase-1最终活化IL-1β，但是IL-1β是多种信号通路活化后的终产物。其中，TLRs信号通路是目前在根尖周病的免疫反应研究中最多的，革兰氏阴性菌主要毒力因子脂多糖通过识别TLR4激活炎症反应，而革兰氏阳性菌脂磷壁酸LTA主要通过识别TLR2。TLRs活化后可激活转录因子NF-κB、AP-1，从而激活多种炎症因子及细胞因子包括IL-1β的表达[14]。本研究中的样本均提取自根尖周肉芽肿及根尖周囊肿病例，且炎症较为严重需配合根尖外科手术或已无法保住牙齿，需要拔牙，这是多种细菌所致的结果，而每一种细菌激活炎症的通路并不一定完全相同，这可能也是导致IL-1β的表达量与NLRP3及Caspase-1不同的主要原因。

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Expression of NLRP3/Caspase-1 inflammasome pathway in clinical chronic periapical periodontitis

WANG Li-na, YE Dan-dan, WANG Jiao-jiao, AO Xiang, LIU Qi-cheng, NIU Wei-dong

(DepartmentofOralMedicine,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

Objective To investigate the expression of NLRP3 inflammasome in clinical chronic periapical periodontitis, and provided the clinical application basis for next research. Methods We collected the apical lesions of chronic periapical periodontitis in patients who need surgery or tooth extraction, and used the method of Real-time qPCR and immunochemistry to detecte the expression of NLRP3 inflammasome. Results NLRP3, Caspase-1 and IL-1β in human periapical periodontitis expression was significantly higher than the control group (P<0.05). Correlation analysis showed that, NLRP3 and Caspase-1 expression are associated with a modest, the expression of IL-1β,Caspase-1 and NLRP3 had low correlation. Conclusion NLRP3 inflammasomes involved in human chronic periapical inflammation.

chronic periapical periodontitis; NLRP3; Caspase-1

国家自然科学基金项目(81171538);辽宁教育厅科学研究一般项目(L2015154)

王丽娜(1981-)，女，辽宁锦州人，讲师。E-mail：lina_li@126.com

牛卫东，教授。E-mail：13840886663@139.com

R781.1

A

1671-7295(2016)06-0538-04

王丽娜，叶丹丹，王娇娇，等.NLRP3/Caspase-1炎性体通路在临床慢性根尖周炎病变组织中的表达[J].大连医科大学学报，2016,38(6)：538-541.

2016-07-20；

2016-11-14)