shRNA沉默ADAM17基因对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

蔡 准，陈国福，吴丽君，张雪鹏，孟祥潮

(华北理工大学附属医院 肿瘤外科，河北 唐山 063000)

论 著 doi:10.11724/jdmu.2016.06.05

shRNA沉默ADAM17基因对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

蔡 准，陈国福，吴丽君，张雪鹏，孟祥潮

(华北理工大学附属医院 肿瘤外科，河北 唐山 063000)

目的 利用shRNA干扰沉默人乳腺癌细胞MCF-7的解聚素-金属蛋白酶17(adisintegrin and metalloproteinases 17，ADAM17)基因，观察其对细胞增殖的影响。方法 针对ADAM17基因设计合成具有特异性的ADAM17-shRNA，经脂质体LipofectamineTM 2000转染MCF-7细胞。实验设对照组(空白PBS)、干扰组(转染干扰无义序列ADAM17-shNC)、实验组(转染ADAM17-shRNA)，采用Realtime PCR检测各组细胞ADAM17 mRNA的表达水平，四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞的增殖活性，流式细胞仪检测细胞周期变化。结果 实验组ADAM17 mRNA的相对表达量显著低于对照组和干扰组，差异有统计学意义(P<0.05)；实验组的MCF-7细胞增殖活性较其他两组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；实验组的MCF-7细胞进入S期(23.60±1.09)%和G2/M期(6.30±0.82)%的比例降低，绝大多数细胞停留在G0/G1期(65.17±1.35)%，细胞周期延缓，与对照组、干扰组相比较差异具有显著性意义(P<0.05)。结论 ADAM17-shRNA对人乳腺癌细胞MCF-7的ADAM17基因具有沉默作用，从而抑制MCF-7细胞的增殖活性，延缓细胞周期进展。

解聚素-金属蛋白酶17；短发夹RNA；乳腺癌；增殖

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。近年来，在全球范围内，每年新增乳腺癌患者约有138万例，占女性癌症病例的23%[1]。中国成为乳腺癌发病率增长最快的国家之一[2]。解聚素-金属蛋白酶17(adisintegrin and metalloproteinases 17，ADAM17)是解聚素-金属蛋白酶家族的重要成员之一。具有解聚素和金属蛋白酶的活性，ADAM17发挥蛋白剪切酶样的作用，释放或启动大量结构和功能不同的分子，在肿瘤细胞中参与多种生物学行为[3-4]。国内外研究均表明ADAM17在多种恶性肿瘤中都有高表达，而在正常组织和细胞中却表达量很少，参与肿瘤的发生、增殖、侵袭和转移的过程[5-7]。本研究利用ADAM17-shRNA转染乳腺癌细胞MCF-7，观察转染后细胞增殖能力的变化，从而揭示ADAM17与乳腺癌细胞增殖的关系。

1 材料和方法

1.1 材 料

人乳腺癌细胞MCF-7系购买于天津肿瘤研究所；四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自上海生物工程有限公司；M-MLV逆转录试剂盒、Platimum SYBR PCR试剂盒、脂质体LipofectamineTM2000均购置于Invitrogen公司；ADAM17-shRNA和ADAM17-shNC载体购买于上海吉玛制药技术有限公司，靶序列如下。

表1 ADAM17的各组靶序列

1.2 细胞培养

将人乳腺癌细胞MCF-7用含有10%胎牛血清、50 U/mL青霉素、50 g/L链霉素的DMEM高糖培养基，置于37 ℃恒温、5%的CO2培养箱中进行常规培养。

1.3 脂质体介导转染法

采用LipofectamineTM2000进行转染，按照Invitrogen公司的产品说明书进行转染操作。实验分为对照组、干扰组和实验组，实验组加入转染试剂和ADAM17-shRNA载体，同样的方法转染干扰组和对照组，干扰组加入转染试剂和ADAM17-shNC载体，对照组加入与转染试剂和ADAM17-shRNA载体混合总量等量的PBS。转染48～72 h后，利用倒置荧光显微镜观察转染率，选取5个不同视野，转染率=荧光个数/透光图细胞个数×100%。

1.4 Realtime PCR法检测ADAM17基因的表达

转染后培养24～48 h，收集各组细胞，经Trizol试剂说明书一步法提取总RNA，测定总RNA的纯度和浓度符合实验要求后采用M-MLV逆转录试剂盒合成cDNA，Platimum SYBR试剂盒进行PCR扩增反应，根据ADAM17引物序列：上游5'-ATCAAACCCTTTCCTGCG-3'，下游5'-CAAACCCATCCTCGTCCA-3’，扩增片段154 bp；β-actin内参引物序列：上游5'-GTCACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3'，下游5'-TTCTTTCCCACATTGCGTTGATTC-3'，扩增片段175 bp；检测ADAM17 mRNA的表达情况，对RT-PCR的结果采用相对定量的方法进行分析。

1.5 MTT法检测细胞增殖活性

取处于对数期细胞，制成单细胞悬液，以1.5×105/孔接种于96孔板中(每组设9个复孔)，培养24 h后，根据脂质体介导转染法操作。转染成功后，分别培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL的四甲基偶氮唑盐(MTT)，继续培养4 h后，弃去上清液，每孔加入150 μL的二甲基亚砜(DMSO)，并均匀震荡10 min，充分溶解，用分光光度计570 nm波长测定各孔的吸光度(OD值)，取每组的平均值。计算肿瘤细胞抑制率，肿瘤细胞抑制率=(1-实验组OD值/对照组细胞OD值)×100%。

1.6 流式细胞技术仪分析细胞周期

转染成功后培养24 h，收集各组细胞悬液，加入预冷2 mL的70%乙醇充分悬浮细胞，并置于4 ℃冰箱固定细胞24 h以上。细胞固定好后，加入碘化丙啶(PI)染液500 μL(浓度50 μg/mL)，染色30 min常温避光。用300钼滤网过滤细胞悬液，选用标准程序经流式细胞仪检测。

1.7 统计学方法

应用SPSS20.0统计软件对实验相关数据进行处理。统计分析进行组间两两比较，采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 转染效率的评价

转染后常规培养48 h，实验中脂质体LipofectamineTM2000转染法的效率高达85%以上。见图1。

图1 倒置荧光显微镜下细胞转染图(×100)Fig 1 Transfection images of MCF-7 cells under fluorescence microscope(×100)A:转染ADAM-shRNA透光检测; B:转染ADAM-shRNA荧光检测; C:A和B合成的图像

2.2 ADAM17 mRNA的表达水平

Realtime PCR法检测ADAM17 mRNA的表达，干扰组与实验组的相对表达量分别为0.95±0.11及0.64±0.11。实验组与对照组及干扰组比较差异有显著性意义(P<0.05)。见图2。

图2 各组ADAM17 mRNA 的相对表达量Fig 2 Relative expression of mRNA ADAM17 in each group*与对照组及干扰组比较，P<0.05

2.3 细胞增殖能力

实验组在培养24 h、48 h和72 h后，与对照组、干扰组相比，细胞的增殖能力明显降低，差异有显著性意义(P<0.05)。见图3，表2。

图3 各组细胞不同时间点的吸光度Fig 3 The optical density of each group in different time

表2 各组细胞不同时间点的吸光度

1)与对照组及干扰组比较，P<0.05

2.4 细胞周期的变化

实验组 G0/G1期的细胞比例为(65.17±1.35)%，高于对照组及干扰组，处于S期和G2/M期的细胞比例为(23.60±1.09)%及(6.30±0.82)%，低于对照组及干扰组，差异有显著性意义(P<0.05)；对照组和干扰组间无显著性差异(P>0.05)。见表3和图4。

图4 MCF-7细胞的流式细胞周期图Fig 4 Cell cycle distribution of MCF-7 cellsa：对照组；b：干扰组；c实验组

表3 各组细胞的G0/G1期，S期，G2/M期比例情况

1)与对照组及干扰组比较，P<0.05

3 讨 论

去整合素-金属蛋白酶家族(adisintegrin and metalloprotease domain, ADAMs)是一类固定于细胞膜上的细胞表面蛋白类家族。研究发现该家族含有40余种类型，属于I型跨膜蛋白[8]。近年来ADAM17在乳腺癌中的作用也越来越被关注。Narita D等[9]研究证明ADAM17在乳腺癌组织中高表达，且随恶性程度、临床分期的增加和淋巴结转移而表达增多。盛英文等[10]采用免疫组化法发现ADAM17蛋白在浸润性乳腺癌中高表达，在乳腺纤维腺瘤及正常乳腺组织中呈低表达，且与腋窝淋巴结转移状况存在正相关性。这些均提示了ADAM17在乳腺癌的发生、发展的整个进程中起到了极其重要的作用，ADAM17极具作为乳腺癌基因靶向治疗的一个新靶点的潜力。

本研究首先利用RNAi技术针对ADAM17基因设计并构建具有特异性的ADAM17-shRNA，经脂质体LipofectamineTM2000转染乳腺癌细胞MCF-7，从基因水平、细胞增殖和细胞周期等方面研究靶向针对ADAM17基因的shRNA对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。结果显示ADAM17-shRNA对细胞ADAM17基因的表达具有抑制作用，实验组细胞的ADAM17mRNA表达水平与对照组及干扰组相比较明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；实验组的细胞增殖活性较对照组与干扰组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；实验组的细胞进入S期和G2/M期的比例降低，绝大多数细胞停留在G0/G1期，与对照组、干扰组比较差异显著(P<0.05)。说明特异性ADAM17-shRNA表达载体能有效沉默ADAM17基因的表达，从而抑制其下游EGFR-PI3K-AKT通路，进而抑制MCF-7细胞的增殖，延缓细胞周期进展[11]。本课题组前期研究发现ADAM17-shRNA转染的SD大鼠BMSC对人乳腺癌细胞细胞MCF-7的增殖能力和体外侵袭能力都有显著的抑制作用[12-13]。RNAi的发现为研究生物体功能基因提供了有效的工具，更提供了特异性阻断基因表达的新方法。

综上所述表明，通过RNAi技术转染ADAM17-shRNA可以沉默乳腺癌细胞MCF-7的ADAM17 mRNA表达水平，从而抑制细胞的增殖活性，延缓细胞周期进展。ADAM17作为抗肿瘤药物研究的一个靶点，为今后以ADAM17为新靶点的靶向药物开发提供了研究方向，同时为乳腺癌临床的诊断和治疗提供实验理论依据。

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Effects of shRNA-targeted ADAM17 gene on proliferation of human breast cancer cells MCF-7

CAI Zhun, CHEN Guo-fu, WU Li-jun, ZHANG Xue-peng, MENG Xiang-chao

(DepartmentofSurgicalOncology,AffiliatedHospital,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To investigate the effect of ADAM17-shRNA on the proliferation of human breast Cancer MCF-7cells by shRNA silence ADAM17 gene. Methods The specific ADAM17-shRNA,which was designed for ADAM17gene,They were transfected into MCF-7 cells by lipofectamine TM2000. Experiment groups were divided into control group(PBS), Interference group(was transfected with ADAM17-shNC) and experience group(was transfected with ADAM17-shRNA). ADAM17 mRNA expression were detected by Real-time PCR, The proliferative ability of MCF-7 cells were detected by MTT, Cell cycle distribution of MCF-7 cells was analyzed by FCM. Results The relative expression of ADAM17mRNA in experience group was significantly lower than control groups and interferencegroup.So the difference was statistically significant (P<0.05), the proliferation of MCF-7 cells in experiencegroup was significantly reduced than control groups and Interference group. So the difference was statistically significant (P<0.05), with experiencegroup, the proportion of MCF-7 cells into the S phase (23.60±1.09)% and G2/M phase (6.30±0.82)% was lowered, with the vast majority of cells remaining in the G0/G1phase (65.17±1.35)%. Compared with the control group and Interference group, so the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusions ADAM17-shRNA could effectively silence the expression of ADAM17 gene in human breast cancer MCF-7 cells, so that the proliferation of MCF-7 cells is inhibited and the cell cycle is delayed.

ADAM17; shRNA;breast cancer;proliferation

河北省自然科学基金项目(C2010001767);唐山市科学技术研究与发展计划项目(14130256B);华北理工大学研究生创新项目(2016S06)

蔡 准(1986-)，男，浙江台州人，硕士研究生。E-mail：caizhun1986317@163.com

张雪鹏，教授。E-mail：syzxp@sina.com

R737

A

1671-7295(2016)06-0542-04

蔡准，陈国福，吴丽君，等.shRNA沉默ADAM17基因对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响[J].大连医科大学学报，2016,38(6)：542-545.

2016-09-04;

2016-10-31)