天女花与广玉兰杂交F1代的ISSR遗传多样性分析

王明媚, Kevin Parris, ZHANG Dong-lin, 金晓玲，李志辉, 杨玉洁

(1.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004; 2.佐治亚大学，美国佐治亚州 雅典 30602; 3.克莱姆森大学，美国南卡莱罗纳州 克莱姆森 29634; 4.长江大学，湖北 荆州 434025)

天女花与广玉兰杂交F1代的ISSR遗传多样性分析

王明媚1,2, Kevin Parris3, ZHANG Dong-lin2*, 金晓玲1*，李志辉1, 杨玉洁4

(1.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004; 2.佐治亚大学，美国佐治亚州 雅典 30602; 3.克莱姆森大学，美国南卡莱罗纳州 克莱姆森 29634; 4.长江大学，湖北 荆州 434025)

利用ISSR分子标记技术探讨了天女花与广玉兰杂交后代9株幼苗的遗传多样性。9株F1代幼苗根据生长健壮的情况依次标记为SA、SB、SC、SD、SE、SF,、SG、SH、SI。选用10个ISSR引物对亲本以及9株F1代幼苗的基因组进行分析。结果表明，11株植物共扩增出96条DNA条带，其中多态性条带为85条，占总条带的88.5 %。UPGMA聚类结果表明所有F1代幼苗与六倍体父本更为相似，与二倍体的母本遗传距离较远。其中SC无论从叶片大小、边缘的形态在9株F1代幼苗中与父本最相似，SG叶片为披针形，在9株F1代幼苗中较为特殊。其余7株F1代幼苗日渐成熟后再根据UPGMA聚类树状图进行形态多样性分析。

F1代遗传多样性；种间杂交；ISSR分子标记技术；天女花；广玉兰；多态性条带

天女花，原产于中国、日本以及朝鲜半岛[1-2]，二倍体(2n=2x=38)[3]落叶灌木或小乔木，一年多个花期，花白色，红色雄蕊。在美国4～8带地域生长良好。广玉兰，塔形，原产于美国弗吉尼亚州至佛罗里达州，东至田纳西州，抗寒性极强，六倍体(2n=6x=114)[3]常绿乔木，花白色。根据种间杂交以及不同倍性间的杂交[2,4]经验，两个品种均具有极大的育种潜力。具有丰富育种经验的木兰科育种学家Dennis Ledvina 是第一个从天女花与广玉兰杂交后代中选择出具有商业价值产品的人。参照Ledvina 先生的经验，于2013年5月在美国南卡莱罗纳州斯巴坦堡社区学院树木园对天女花和广玉兰进行杂交。3个月后收获到杂交种子并通过悬浮法获得25颗具有活力的F1代种子。去掉假种皮，用10 %的次氯酸钠进行冲洗后把种子轻轻放在湿润的泥炭块中冷处理5个月。2014年3月共有21颗种子萌发。萌发后，有9株F1代幼苗(根据生长健壮的情况依次标记为SA, SB, SC, SD, SE, SF, SG, SH, SI)被移栽到1加仑的容器中。通过流式细胞计数法测得所有的F1代育苗的染色体倍性为四倍体(2n=4x=76)[3]。后期生长表明，所有F1代幼苗叶片均为常绿，同六倍体父本一致。但是，叶片的大小、形状以及颜色各有不同。且由于F1代幼苗树龄小，其生长习性和花的特征了解不很清楚。因此，有必要进行DNA分子鉴定掌握F1代的遗传变异。

分子技术，像cpDNA分析[5]，已经广泛应用于木兰科植物的研究中。ISSR分子标记技术是一种新的植物遗传性研究技术[6-7]。分子技术广泛应用于植物遗传结构、遗传多样性以及遗传关系的研究中[8]。在此研究中，本文试图分析出F1代与亲本之间的遗传变异以及F1代幼苗之间的遗传多样性，为木兰科F2代优良植株的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

本试验选取2个亲本和生命力旺盛的9株F1代幼苗(SA, SB, SC, SD, SE, SF, SG, SH, SI)上的新鲜叶片提取DNA。

1.2 试验方法

1.2.1 总DNA提取 从F1代9株幼苗以及2个亲本植株上均选取1片新鲜健康的叶片，用其一小部分放在液氮中提取DNA，多余叶片放在-80 ℃冰箱中储存。使用DNA提取试剂盒QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit提取DNA。

1.2.2 DNA质量检测 提取的DNA样品用spectrophotometer (ThermoScientific NanoDrop Lite)紫外分光光度计测定波长260和280 nm的光吸收值，以A260/A280比值判断DNA样品的纯度，并直接观测紫外分光光度计上样品的浓度。检测完毕的DNA放在-20 ℃冰箱中储存待用。本试验以2个亲本以及9个F1代DNA为模板，从100个ISSR引物中筛选出10个扩增条带清晰的引物用于11个植物的ISSR分析。

1.2.3 ISSR-PCR反应体系及反应循环参数 PCR反应体系(20 μl)为：AmpliTaqGold 360 Master Mix 10 μl，模板DNA 3 μl，引物 1 μl，最后用ddH2O补足至20 μl。

PCR反应采用如下循环参数定为：预变性94 ℃ 5 min，在变性94 ℃ 30 s，退火50～60 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1.5 min循环40次，最后一次延伸为72 ℃ 7 min，然后设置PCR温度为4 ℃。

1.2.4 2个亲本以及9个F1代样本的ISSR-PCR扩增 用筛选的引物对11个DNA样本在相应的退火温度下进行PCR扩增，扩增产物于1.2 %琼脂糖凝胶并加入2滴EB于0.5X缓冲液中电泳，电压120 V，约80 min后取出。使用100 bp DNA ladder作为参照标准，凝胶在UV灯下进行观察拍照。

1.2.5 数据统计 PCR扩增产物在凝胶的某个相同迁移率的具体位置上有DNA条带记为1，无DNA条带记为0。剔除模糊不清晰的条带。使用PAUP 4.0 分析和估计亲代与F1之间的基因差异。

2 结果与分析

2.1 ISSR-PCR引物退火温度的筛选

ISSR对PCR退火温度极为敏感，同一引物对于不同退火温度不一样，而同一物种不同的引物，退火温度也不相同。因此，对于ISSR分析而言，引物的筛选和退火温度至关重要。本试验从100个ISSR引物中逐步筛选出10个扩增条带清晰的引物，这10个ISSR引物相应的退火温度在52～56 ℃，其中引物UBC807，UBC811，UBC812，UBC827，UBC828退火温度最低，为52 ℃；引物UBC834，UBC835退火温度最高，为56 ℃。

2.2 ISSR-PCR扩增结果及11个样本的遗传多态性

10个ISSR引物共扩增出96条清晰的条带，条带大小为200～1500 bp，其中85条具有多态性，比例为88.5 %。不同引物扩增大条带数为7～15。平均每个引物扩增的条带数为9.6。其中引物UBC817扩增出的具有多态性条带比例最高，为100.0 %；引物UBC817扩增出的具有多态性条带比例最低，为57.1 %(表1)。对于每个分类单元，扩增出的条带数介于45(XX，Magnoliasieboldii‘Colossus’)至58(SG和SI)之间。

2.3 遗传距离分析

供试材料的遗传距离在0.167～0.604。因为天女花(Magnoliasieboldii‘Colossus’)(XX) 为落叶，叶背没有棕色绒毛，且叶片较大，而广玉兰 (Magnoliagrandiflora‘Kay Parris’)(XY) 叶片较小且常绿。经过ISSR分析，它们之间的遗传距离最大，为0.604。在F1代样本之间，遗传距离最小的两个样本为SH和SI，它们之间的遗传距离为0.167；遗传距离最大的2个样本为SA和SG，它们之间的遗传距离为0.396。F1代样本与母本之间的平均遗传距离为0.279，与父本之间的平均遗传距离为0.494。从遗传距离上看，六倍体父本比二倍体母本的贡献力大。

2.4 ISSR聚类分析树状图

根据ISSR数据结果，按UPGMA法构建了亲本与9个F1代样本之间的遗传关系聚类分析树状图(图1)。从聚类图中可以看出，可将11个供试材料分为2类。

表1 10个引物序列、退火温度、扩增条带数以及多态性

图1 ISSR分析亲本与F1代样本聚类树状图Fig.1 Dengrogram of Magnolia parents and F1 siblings based on ISSR data

第1类为母本。第2类为父本及9个F1代样本，第2类中又分为4个亚类(图1)。父本与SC之间遗传距离最近为0.219。且从形态学上观察，SC叶片的形状以及大小最接近父本。SH和SI均具有小叶片，生长缓慢，以及相似的树形。两者从遗传角度分析，也是遗传距离最接近的两个F1代样本。这4个样本被聚为第1个亚类。第2个亚类包含生长最快的SA，以及亚聚类SB和SF。从遗传距离上判断它们彼此接近，但从目前的生长及形态特征上无显著差异。第3个亚类包含SD和SE。且它们也具有相似的形态特征。第4个亚类为SG，是唯一的具有可辨别的绒毛叶片的植株。

3 结论与讨论

(1)特异性条带与条带组合类型对将来的研究至关重要[12]。在此试验中，共获得17条特异性条带，其中8条来自母本，只有1条来自父本。通过亲本DNA重组，4个F1代样本中出现特异性条带。分别为SE和SG均有3条，SC和SD各有1条。因为SG叶片为披针形且有3条特异性条带，很可能控制披针形叶片形状的基因是3条特异性条带中的1条。但是，此假设还需要进一步证实。由于F1代样本较小，生长程度还不足以去推测带型与生长的关系，需要进一步的研究。

(2)ISSR分析结果表明SC与父本之间的亲缘关系最近，且所有F1代样本均与父本相似。这也证实了F1代样本基因组DNA从母本与父本获得的基因组DNA的比例为1∶3。通过ISSR分析，9个F1代样本与父本分享11条带，而只有3条带是9个F1代样本从母本获得。待9个F1代样本成熟将继续观察其生长习性以及花的特征，为未来木兰科育种做准备。

[1]Callaway D J. The world ofMagnolias[J]. Timber Press, Portland, USA,1994.

[2]Parris J K.Magnoliagrandiflora, a noble species with a complementary court of cultivars[J]. Royal Horticulture Society’s Rhododendron, Camellia, Magnolia Yearbook. Devon, UK,2012,75-89.

[3]Parris J K, T.G. Ranney, H.T. Knap W.V. Baird. Ploidy levels, relative genome sizes, and base pair composition inMagnolia[J]. J. Amer. Soc. Hort. Sci, 2010, 135(6): 533-547.

[4]Figlar, R.B. , H.P. Nooteboom. Notes on Magnoliaceae IV. Blumea, 2004, 49:1-14.

[5]Azuma H, L.B. Thien, S. Kaeano. Molecular phylogeny ofMagnoliabased on chloroplast DNA sequence data and floral scent chemistry[J]. Proc. Intl. Symp. Family Magnoliaceae, 2000, 219-227.

[6]Hua H Y, L.Y. Zhi. Genetic diversity and relationship of endangered plantMagnoliaofficialis(Magnoliaceae) assessed with ISSR polymorphisms[J]. Biochemical Systematics and Ecology, 2011, 39:71-78.

[7]Yang, Yujie, Donglin Zhang,et al. Genetic relationships ofMicheliaL. species revealed from ISSR markers[J]. HortScience, 2013, 48(9): 258-259.

[8]张 宇，王长江，唐志鹏，等.ISSR分子标记对杧果实生苗父本的早期鉴定[J].南方农业学报,2014,45(1):7-11.

[9]Chen LY, F.J. Chen. High genetic diversity and small genetic variation among populations ofMagnoliawufengensis(Magnoliaceae), revealed by ISSR and ARAP markers[J]. Electronic Journal of Biotechnology, 2014,17：268-274.

[10]Li H, C.J. Ruan, J.A. Teixeira da Silva. Identification and genetic relationship based on ISSR analysis in a germplasm collection of sea buckthorn (HippophaeL.) from China and other countries[J]. Scientia Horticulturae, 2009, 123:263-271.

[11]Li JM,Z.X. Jin. Genetic structure of endangeredEmmenopteryshenryiOliv. based on ISSR polymorphism and implications for its conservation[J]. Genetica, 2008, 133:227-234.

[12]Lv YP, Z.H. Hu. Analysis of genetic variation in selected generations of ‘Whole Red’ patternCyprinuscarpiovar.colorusing ISSR markers[J]. Biochemical Systematic and Ecology,2012, 44:243-249.

[13]Zhang, Donglin, Michael A. Dirr, et al. Price. Discrimination and genetic diversity of Cephalotaxus accessions using AFLP markers[J]. Journal of the American Society for Horticulture Science,2000, 125(4): 404-412.

(责任编辑 李 洁)

Genetic Variation ofMagnoliasieboldiiK. Koch ‘Colossus’ andMagnoliagrandifloraL.‘Kay Parris’ F1Seedlings Using ISSR Markers

WANG Ming-mei1, 2, PARRIS Kevin3, ZHANG Dong-lin2*, JIN Xiao-ling1, LI Zhi-hui1, YANG Yu-jie4

(1.Central South University of Forestry and Technology, Hunan Changsha 410004, China; 2.University of Georgia, Athens, GA 30602, USA; 3.Clemson University, Clemson, SC 29634, USA; 4.Yangtze University, Hubei Jingzhou 434025, China)

ISSR markers were used to analyze genetic variations and assessed inheritance of nine F1seedlings. Plants were accessioned and assigned a letter, with A being the most vigorous and I being the least vigorous individuals. A total of 96 bands were generated from 10 primers, in which 85 bands (88.5 %) were polymorphic. UPGMA tree revealed that all the seedlings were much closer to their hexaploid pollen parent (M.grandiflora‘Kay Parris’) and more distant from their diploid seed parent(M.sieboldii‘Colossus’), supporting early foliage morphology. Seedling C is the most similar to the pollen parent, both in regard to foliage proportions, margin undulation, and proximity. Seedling G is unique among the F1, displaying lanceolate leaves. Other seedlings grouped within the tree have slight morphological variations that may be analyzed for correlation to the UPGMA tree as they continue to mature and growth habit variations become evident.

F1variation; Interspecific hybrid; ISSR markers;Magnoliasieboldii‘Colossus’;Magnoliagrandiflora‘Kay Parris’; Polymorphic bands

1001-4829(2016)09-2225-04

10.16213/j.cnki.scjas.2016.09.037

2015-10-12

林业公益性行业科研专项经费资助项目(2014047 10)

王明媚(1989-)，女，河北唐山人，森林培育硕士研究生，E-mail: mingmei16@sina.cn, *为通讯作者。

S685.15

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