生物发酵法改善菜粕品质的研究

何小丽 李 冲 张妮娅 孙铝辉 齐德生

生物发酵法改善菜粕品质的研究

何小丽 李 冲 张妮娅 孙铝辉 齐德生

（华中农业大学动物科技学院，武汉 430070）

通过生物发酵的措施来改善菜粕的营养价值。采用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、芬氏纤维微菌以及从土壤中筛选的三株菌（命名为T-1、T-2、T-3）分别对菜粕进行单菌固态发酵，以降低硫苷、单宁、粗纤维和提高酸溶蛋白、蛋白质溶解度为目标筛选出高效菌株，将这些高效菌株以不同比例进行混合，获得最优组合并优化其发酵条件，将发酵菜粕替代基础饲粮中25%、50%、75%、100%的未发酵菜粕，通过肉鸡饲养试验验证发酵菜粕的使用效果。结果表明：1）单菌发酵以地衣芽孢杆菌、T-1、芬氏纤维微菌的效果最优，其中地衣芽孢杆菌能显著降低硫苷、单宁的含量（P＜0.05），T-1能显著提高酸溶蛋白和蛋白质溶解度（P＜0.05），芬氏纤维微菌能显著降低粗纤维的含量（P＜0.05）；2）混菌发酵以地衣芽孢杆菌、芬氏纤维微菌、T-1按1∶2∶2的比例混合时效果最优，在混合菌液总有效菌数为109CFU／mL、接种量为10%、料水比为1∶0.6、发酵温度为37℃的条件下，发酵48 h时，硫苷降解率达89.4%（P＜0.05），单宁降解率为28.6%（P ＜0.05），粗纤维含量由10.0%降至8.6%（P ＜0.05），酸溶蛋白提高了254.0%（P ＜0.05），蛋白质溶解度提高了31.6%（P＜0.05）；3）使用发酵菜粕替代未发酵菜粕后，显著提高了肉鸡1～21日龄的平均日增重（P＜0.05），显著降低了肉鸡1～21日龄的料重比（P＜0.05）。通过生物发酵能有效降低菜粕中的抗营养因子，提高其营养价值，发酵菜粕能改善肉鸡生长性能。

菜粕 微生物发酵 抗营养因子 酸溶蛋白 蛋白质溶解度 肉鸡 生长性能

菜粕是一种营养价值接近于豆粕的植物性蛋白饲料资源，其蛋白质量分数为35%～45%，必需氨基酸含量丰富且组成较为合理［1］，富含钙、磷、镁、硒等矿物质元素，其中硒含量是植物性蛋白中含量最高的［2］。但菜粕中存在硫苷、单宁、植酸等多种抗营养因子［3-4］，在一定程度上影响了饲料的安全性，且菜粕中粗纤维含量高，蛋白质的生物利用率低［5］，动物过多采食易产生中毒，造成脏器如甲状腺和肝脏的损伤，甚至引起畜禽死亡［6］，极大的限制了其在畜禽饲粮中的使用。为改善菜粕的饲用价值，国内外许多学者对菜粕的脱毒方法进行了大量研究，包括理化脱毒法、微生物发酵法、遗传育种法。其中微生物发酵法效果优良，安全有效［7］。微生物发酵包括单菌发酵和混菌发酵，单菌发酵效果较为单一，菜粕品质改善效果不明显，而混菌发酵可以同时产生多种酶，弥补单菌发酵的缺陷［8］。本试验研究了单菌的发酵效果，筛选高效菌株并进行组合，研究了混菌发酵效果及其适宜的发酵条件，考察发酵菜粕对菜粕营养价值的影响，并通过肉鸡饲养试验验证发酵菜粕的使用效果，以期为实际生产中菜粕资源的利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母、黑曲霉：武汉某公司；芬氏纤维微菌为研究室自行保存；菜粕：湖北某油脂加工厂。

T-1、T-2、T-3为本研究室自行分离获得的3株菌。分离方法为将菜粕放入枯树叶堆中7 d后，用灭菌的生理盐水，依次梯度稀释，使其浓度梯度为10-1、10-2、10-3、10-4。分别取10-3和10-4稀释液100 μL，加入固态营养琼脂培养基中，涂布均匀，倒置于37℃和28℃恒温培养箱中培养。挑取不同形态的典型菌落，分别划线接种于新的固体培养基中，连续转接3次分离纯化菌株，取转接3次后的生长菌株作为从土壤中筛取的菌株，分别命名为T-1、T-2、T-3。

1.2 试验方法

1.2.1 单菌固态发酵

取30 g菜粕于250 mL三角瓶中，加入30 mL蒸馏水，混匀，分别将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、T-1、T-2、T-3（菌液浓度108CFU／mL）以10%的接种量接种于菜粕中，每组3个重复，振摇混匀后于37℃恒温培养箱中培养48 h，每天定时翻料。发酵结束后，将发酵菜粕在65℃烘箱中烘干，室温下回潮24 h，测定发酵菜粕中的硫苷、单宁、粗纤维、粗蛋白质、酸溶蛋白的含量及蛋白质溶解度。

1.2.2 以粗纤维为降解目标的优化试验

考虑到单菌发酵可能对粗纤维的降解效果有限，因此，本试验特选取了纤维素酶和对粗纤维有降解效果的芬氏纤维微菌进行了粗纤维的降解试验。取100 U／g纤维素酶10、20、40 mg分别加入菜粕中，按1.2.1的方法进行发酵，测定菜粕中粗纤维的含量；取本研究室保存的芬氏纤维微菌（菌液浓度108CFU／mL）以10%的接种量加入菜粕中，按1.2.1的方法发酵处理，测定菜粕中粗纤维的含量。

1.2.3 混菌发酵中不同菌株配比优化试验

根据1.2.1、1.2.2 的试验结果筛选出3 株高效菌株，分别命名为A菌、B菌、C菌。将3种菌株以不同的添加比例加入菜粕中，添加比例如表1所示，按1.2.1的方法发酵处理，选取最优的发酵比例。

表1 菌株配比

1.2.4 混菌发酵的条件优化

按照菌液浓度、料水比、发酵时间、发酵温度，设计4因素3水平试验（表2），进行固态发酵，按1.2.1的方法发酵处理，确定最适发酵条件。

表2 L9（34）正交设计表

1.3 肉鸡饲养试验

选用1日龄健康科宝肉鸡140羽，随机分为5个组，每组4个重复，每个重复7羽。饲养试验为21 d。按照上述最优发酵条件发酵菜粕，进行肉鸡饲养试验。试验组Ⅰ使用20%未发酵菜粕（基础饲粮），试验组Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分别用发酵菜粕替代基础饲粮中25%、50%、75%、100%的未发酵菜粕，其余组分保持不变。基础饲粮组成及营养水平见表3。

表3 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）

1.4 测定指标及方法

硫苷参照王宁惠［9］的方法进行测定；单宁参照SN／T 0800.9—1999测定；粗纤维参照GB／T 6434—2006测定；粗蛋白参照GB／T 6432—1994测定；酸溶蛋白参照QB／T 2653—2004测定；蛋白质溶解度参照DB13／T 812—2006测定。

肉鸡饲养试验于第21天时称取试验鸡的个体重，并记录各组鸡的平均日增重、平均日采食量和饲料转化效率。

1.5 数据统计与分析

采用SPSS 19.0对试验结果进行分析处理，用Duncan氏多重比较进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。所有试验结果均以平均数±标准差表示。

2 结果

2.1 单菌固态发酵

不同菌株的发酵结果见表4。由表4可知，市售五种菌株均可有效降解菜粕中的硫苷（P＜0.05），其中地衣芽孢杆菌和黑曲霉的降解率最高，达到了58.1%和60.0%，地衣芽孢杆菌能显著降低单宁的含量（P ＜0.05），降解率为46.9%，而五种菌株对粗纤维均没有降解效果；发酵后的粗蛋白含量都有所提高；经过枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黑曲霉发酵后的菜粕酸溶蛋白含量均提高了100%左右，但经过五种菌株发酵后的菜粕蛋白质溶解度，除地衣芽孢杆菌外，均显著降低（P＜0.05）。根据这些结果，本研究选择地衣芽孢杆菌作为后续混菌发酵的菌株。

由本研究室自行分离的3株菌发酵结果可知，T-1、T-2、T-3 3株菌均能显著降低硫苷的含量（P ＜0.05），其降解率分别为68.4%、60.3%、50.3%。发酵后的粗蛋白、酸溶蛋白都有显著提高（P ＜0.05），酸溶蛋白含量分别提高了754.2%、643.0%、438.2%。T-1显著提高了蛋白质溶解度（P＜0.05），T-2发酵处理后的蛋白质溶解度无变化，而T-3显著降低了蛋白质溶解度（P＜0.05）。3种菌株对单宁和粗纤维均没有降解效果。根据这些结果，本研究选择T-1作为后续混菌发酵的菌株。

2.2 以粗纤维为降解目标的优化试验

本试验选取了纤维素酶和芬氏纤维微菌来评价其对菜粕中粗纤维的分解情况，结果见表5。由表5可知，随着纤维素酶添加量的增加，菜粕中粗纤维的含量显著降低（P＜0.05），添加20 mg纤维素酶的效果最好，降解率为15.7%；芬氏纤维微菌能有效降低菜粕中粗纤维的含量，粗纤维含量由11.7%降低至7.7%，降解率达到34.3%。根据粗纤维的降解效果选择芬氏纤维微菌作为后续混菌发酵的菌株。

2.3 混菌菌株在不同比例条件下的发酵效果

由表6可知，不同的发酵比例条件下发酵效果有所差异。在发酵比例为地衣芽孢杆菌∶T-1∶芬氏纤维微菌＝1∶2∶2的条件下，发酵效果最好。硫苷的降解率为66.1%，单宁的降解率为39.8%，粗纤维的降解率为21.7%，酸溶蛋白提高了116.0%，而蛋白质溶解度仍有所下降。

表4 不同菌株固态发酵对菜粕常规营养成分的影响（干物质基础）

表5 纤维素酶和芬氏纤维微菌对菜粕中粗纤维的降解效果（干物质基础）

表6 混菌发酵筛选最佳发酵比例结果（干物质基础）

2.4 混菌发酵的条件优化

在上述最佳发酵比例条件下进行发酵条件的优化，结果见表7。由表7可知，试验组4即发酵条件为菌液浓度为109CFU／mL，料水比为1∶0.6，发酵温度37℃，发酵时间48 h，其发酵效果最好。菜粕中硫苷降解率达89.4%，最终含量为3.58 μmol／g，单宁的降解率为28.6%，粗纤维质量分数由10.0%降为8.6%，酸溶蛋白质量分数由5.7%提高至20.8%，蛋白质溶解度由31.8%提高至41.8%。

2.5 发酵菜粕在肉鸡日粮中的使用效果

由表8可知，各组肉鸡平均日采食量均无显著差异。与对照组相比，随着发酵菜粕替代比例的增多，各组肉鸡平均日增重显著上升（P＜0.05），料肉比显著下降（P ＜0.05）。

3 讨论

3.1 不同菌株的发酵效果

微生物发酵能有效改善菜粕的品质。前人研究发现，不同菌株发酵效果有所不同。枯草芽孢杆菌可产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶等活性较高的酶，可以消除菜粕中的抗营养因子，同时还可以降低蛋白质的分子质量，增加小肽的含量［10-11］。酵母菌含有丰富的菌体蛋白，氨基酸组成合理，可分泌多种淀粉酶、蛋白酶、脂酶等，富含B族维生素，可作为优质的蛋白源［12］。乳酸菌发酵可产生乳酸、降低饲料pH，产生有机酸、细菌素、过氧化氢、双乙酰的功能天然抑菌物质，从而控制大多数腐败菌及致死菌的生长［13］。黑曲霉发酵所产生的酶类能降低菜粕中的单宁和纤维类物质［14］。

在前人试验基础上，本试验选取发酵效果较好的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母和黑曲霉5种菌株进行菜粕的单菌固态发酵试验。研究结果发现，5种菌株均能显著降解饲料中的硫苷，其中地衣芽孢杆菌和黑曲霉效果最好，菜粕中硫苷降解效果不同主要原因在于各菌自身所分泌的酶系的不同。同时地衣芽孢杆菌还能有效降解菜粕中的单宁。通过固态发酵后，菜粕的粗蛋白、酸溶蛋白都有显著提高，这与付敏等［15］的报道一致，这表明固态发酵过程中菌株能产生蛋白酶并作用于蛋白质，将其分解为多肽及游离氨基酸，从而改善菜粕蛋白质的品质，使菜粕的适口性更佳。同时，通过从土壤中筛选能在菜粕中生存的菌株，获得3株菌后进行固态发酵。3株菌均能有效降解菜粕中的硫苷，而T-1菌株还能提高酸溶蛋白的含量和蛋白质溶解度，这表明T-1菌株可能在代谢中能产生更多降解菜粕中蛋白的酶类。芬氏纤维微菌是本研究室自行分离保存的菌种，据报道，芬氏纤维微菌具有分解粗纤维的能力，本试验用纤维素酶和芬氏纤维微菌分别进行了粗纤维降解试验，试验结果发现，芬氏纤维微菌的效果更优于纤维素酶，可能原因是芬氏纤维微菌在发酵过程中，不断生长繁殖，产生了更多的能降解纤维素的酶类。

3.2 菌株的组合效应

单菌发酵效果较为单一，而混菌发酵不同菌株之间可能产生协同作用，增强发酵效果。毛小伟［16］在菜粕发酵菌株的优化及固体发酵工艺的初步研究中，分别用枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、侧胞芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和酿酒酵母单菌发酵菜粕，对硫苷的脱毒率分别为51.27%、54.53%、58.36%、63.76%和64.31%，而用复合菌株发酵菜粕后测得的硫苷降解率最高达到73.44%，并且粗蛋白含量的提高量较单菌发酵也显著提高。本研究中，混菌发酵有效降低了菜粕中硫苷、单宁以及粗纤维的含量，这与单菌发酵结果相符。但是由于混菌发酵的总接种量与单菌发酵的一致，所以与单菌发酵相比，每种菌株的添加量反而降低，所以三菌混合发酵后的硫苷和单宁的降解率并没有高于单菌发酵的结果。单菌发酵效果单一，而混菌发酵的3种菌株可能产生了互利协同作用，从而降低抗营养因子的含量，提高蛋白品质。

表7 正交设计筛选最佳发酵条件试验结果（干物质基础）

表8 发酵菜粕替代未发酵菜粕对1～21日龄肉鸡生长性能的影响

当菌种在不同添加比例条件下，发酵效果也会有所差异。本研究中，在发酵比例为地衣芽孢杆菌∶芬氏纤维微菌∶T-1＝1∶2∶2的条件下发酵效果最好，菜粕中的硫苷、单宁和粗纤维含量均发生了显著的降低，酸溶蛋白的含量有所提升，而蛋白质溶解度却有所下降，所以有必要对混菌发酵的发酵条件进行优化。

3.3 生物发酵工艺的优化

不同微生物有其适宜的生长条件，在不同发酵条件下，发酵效果存在差异。付敏等［15］研究发现菌种接种比例和料水比对发酵结果具有显著影响，随着菌液添加比例的增加，小肽和游离氨基酸含量显著增加；Batal等［17］研究发现发酵底物含水量对固态发酵过程中植酸酶的产生具有显著影响，在含水量为60%时植酸酶的产量最高。本试验对菌液浓度、料水比、发酵温度和发酵时间等条件探究其发酵效果，发现不同发酵条件下发酵效果不一样。

发酵温度是影响固态发酵的一个重要因素，发酵温度会影响微生物的生长繁殖，酶的活性以及代谢产物的形成［18］。本试验的结果表明，最适的发酵温度为37℃，因为本试验的复合菌株包括地衣芽孢杆菌、T-1和芬氏纤维微菌，这3株菌的最适生长温度均为37℃，此时既能促进菌株的生长，又能使菌体代谢产生的活性物质含量达到最大，从而使发酵效果达到最优。

底物含水量的多少对微生物的生长及其代谢能力有重要影响。提高发酵初始含水量，可以增加发酵底物营养物质的溶解和微生物代谢产物的扩散以促进微生物的生长［19］，还可以增加水解酶的产生并促进水解酶的扩散［20］；但初始含水量过高会造成发酵底物多孔性的降低，导致氧传质和热传质的降低［20］。同时会造成颗粒结块、通气不畅和染菌。通常，在一定范围内，活性物质的含量随着含水量的增加而增加。本试验表明，在料水比为1∶0.6时发酵效果最好，在此条件下，既能保证微生物生长的需要，又不会造成菜粕结块，通气不畅等影响。

菌液接种量是指接种菌液的体积或菌液浓度。接种量过低，菌体生长繁殖速度慢，不利于生成代谢产物降解抗营养因子；而接种量过大，致使菌体生长速度加快，会消耗大量的营养物质，造成损失。本试验通过提高菌液浓度，缩短了菌种生长繁殖及生成代谢产物的时间，从而缩短发酵时间。试验结果表明，菌液浓度为109CFU／mL时发酵效果最好。

随着发酵时间的延长，菜粕中有毒有害物质减少的越多，但时间过长，则会影响菜粕中其他营养成分，且周期相应延长［21］。周世宁等［22］使用曲霉R10发酵菜粕24 h，发现脱毒率仅有30%；Rakariyatham等［23］试验发现当发酵时间为60 h和96 h时，硫苷被彻底降解。目前为保证良好脱毒效果，又缩短生产周期，一般采用发酵24～48 h。本试验的结果表明，发酵时间为48 h发酵效果最好，此时硫苷的含量仅为3.58 μmol／g，降解率达到最高。

3.4 发酵菜粕在肉鸡饲料中的应用问题

发酵菜粕在肉鸡饲料中的应用有许多研究，余勃等［24］研究固态发酵菜粕替代日粮中豆粕对肉仔鸡生长性能的影响，分别用5%、10%和15%的固态发酵菜粕替代豆粕，结果表明日粮中使用15%的发酵菜粕后肉鸡前期和后期的日增重均呈显著下降趋势，但添加量不超过10%时，对其日增重和饲料转化效率均无显著影响，日粮中使用15%以内的发酵菜粕对肉鸡肝脏和甲状腺指数也无显著影响，所以固态发酵菜粕可以替代日粮中的部分豆粕，但替代量以不超过10%为宜。

本研究中，分别以25%、50%、75%和100%的发酵菜粕替代日粮中未发酵菜粕，缓解了未发酵菜粕对肉鸡1～21日龄平均日增重和料重比的影响。这一结果表明，通过固态发酵处理能提高菜粕的营养利用率，发酵处理后降低了菜粕中抗营养因子的含量，产生的酸溶蛋白更有利于动物的吸收，从而提高了菜粕的营养价值，改善了肉鸡的生长性能。

4 结论

4.1 本试验以降低硫苷、单宁、粗纤维和提高酸溶蛋白、蛋白质溶解度为目标筛选出了地衣芽孢杆菌、T-1和芬氏纤维微菌等3株高效菌株。

4.2 在发酵比例为地衣芽孢杆菌∶芬氏纤维微菌∶T-1＝1∶2∶2的条件下发酵效果最好。在接种量为10%，菌液浓度为109CFU／mL，料水比＝ 1∶0.6，发酵时间为48 h，发酵温度为37℃的条件下发酵效果最优。

4.3 与未发酵菜粕相比，发酵菜粕显著提高了肉鸡平均日增重（P＜0.05），显著降低了肉鸡料重比（P＜0.05），有效改善了肉鸡的生长性能。

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Biological Fermentation to Improve the Quality of Rapeseed Meal

He Xiaoli Li Chong Zhang Niya Sun Lühui Qi Desheng
（Huazhong Agricultural University，College of Animal Science and Technology，Wuhan 430070）

The study was conducted to improve the nutritional value of the rapeseed meal by biological fermentation.Bacillus subtilis，Bacillus licheniformis，Lactobacillus plantarum，Saccharomyces cerevisiae，Aspergillus niger，Cellulosimicrobium funkei strain and three strains（named as T-1，T-2，T-3）screened from soil were used to ferment rapeseed meal respectively in a single fungus solid manner.The strains which got low glucosinolate，tannic，crude fiber content and improved TCA，protein solubility in rapeseed meal after fermentation were selected and mixed in different proportions，to obtain the optimal combination and optimized fermentation conditions，The broilers wre fed basal diets in which part of unfermented rapeseed meal were replaced by 25%，50% ，75% ，100%fermented rapeseed meal.The results showed that：1）Single strain fermentation with Bacillus licheniformis，Cellulosimicrobium funkei strain and T-1 could get the best effects.Bacillus licheniformis could reduce glucosinolate，tannic contents significantly（P ＜0.05），T-1 could improve TCA and protein solubility （P ＜0.05），Cellulosimicrobium funkei strain can reduce crude fiber significantly（P ＜0.05）；2）Mixed fermentation with Bacillus licheniformis，Cellulosimicrobium funkei strain and T-1 could get optimal effect by 1∶2∶2 ratio.Fermented rapeseed meal 48 h under 37 ℃ with effective bacteria of 109CFU／mL，10%inoculum size，feed water ratio in 1∶0.6，the degradation rate of glucosinolate could reach to 89.4% （P ＜0.05），tannic degradation rate of 28.6% （P ＜0.05），crude fiber decreased to 8.6%from10.0%（P ＜0.05），TCA improved 254.0% （P ＜0.05），protein solubility improved 31.6%（P ＜0.05）；3）Fermented rapeseed meal significantly increased the average daily gain of 21-day-old broiler（P＜0.05），and significantly reduced the feed conversion ratio （P ＜0.05）.Biological fermentation can effectively reduce the anti-nutritional factors in rapeseed meal，and improve its nutritional value，fermented rapeseed meal can improve broiler performance.

rapeseed meal，microbial fermentation，anti-nutritional factors，TCA，protein solubility，broiler，growth performance

S816.4

A

1003-0174（2016）11-0085-07

饲料资源开发与高效利用关键技术研发与集成示范（2011BAD26B01-3）

2015-04-15

何小丽，女，1990年出生，硕士，动物营养与饲料科学

齐德生，男，1965年出生，教授，饲料安全与饲料生物技术