大豆分离蛋白及7S、11S蛋白对肝脏的保护作用

刘维维 叶昱辉 胡 君 聂素萍 何 慧

大豆分离蛋白及7S、11S蛋白对肝脏的保护作用

刘维维 叶昱辉 胡 君 聂素萍 何 慧

（华中农业大学食品科技学院；环境食品学教育部重点实验室，武汉 430070）

为探究大豆蛋白是否具有保肝作用，采用昆明种雄性小鼠作为试验对象，建立四氯化碳急性肝损伤模型，通过灌胃方式1次／d给予不同组别小鼠不同剂量、不同成分（大豆分离蛋白SPI、11S、7S）的蛋白（300、500、700 mg／kg），并设一组大豆蛋白饲料组（SPI占比为20%），持续15 d，于末次给药后注射CCl4油溶液（10 mL／kg，0.15%）。通过测定血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活力，肝脏中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力及肝脏指数评价保肝效果。结果显示，每天摄入700 mg／kg的SPI对由四氯化碳致肝损伤鼠有显著的保护作用；与模型组相比，700 mg／kg的7S蛋白能显著抑制由四氯化碳引起的血清中ALT、AST活力升高和小鼠肝脏中MDA含量的升高，并能显著提高其肝脏中的GSH含量、GSH-Px活力（P＜0.05）。大豆蛋白可抵御CCl4致化学性肝损伤，其中的7S蛋白是主要的保肝活性成分。

大豆分离蛋白 7S蛋白 11S蛋白 四氯化碳 保肝作用

大豆蛋白是含有人体8种必需氨基酸的全价植物蛋白，其营养价值可与牛奶相媲美。食用大豆蛋白可以弥补摄入动物蛋白时伴随的胆固醇升高和谷物摄入时的氨基酸不平衡的缺陷。1999年，美国食品药物管理局（FDA）发布了大豆蛋白的健康声明，即“每天食用25 g大豆蛋白能够降低心脏病、心血管疾病的风险”。然而，目前我国居民豆类蛋白摄入量较少，特别是大豆蛋白的摄入量仅为5%，远低于推荐量的20%［1］。我国大豆主要用于生产豆油，其下脚料豆粕富含蛋白质，如何使其中的蛋白质得到高值化利用，具有重要意义。

近年来，脂肪肝、酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌的发病率不断上升，肝癌发病率仅次于肺癌、消化道癌，位居第3位。肝脏素有人体的“生命塔”之称，是人体重要的免疫器官，人体的各种代谢解毒、免疫功能都需要肝脏承担。因此，寻求高活性保肝药物具有重要意义。目前我国已研制开发的对化学性肝损伤具有保护作用的保健食品已有二十余种，可按来源分为4类：由中草药或其提取物研制如灵芝多糖、大豆皂苷、枸杞等；公认的具有抗氧化的营养物质如牛磺酸、硒、维生素E等；一些特殊动物如牡蛎、蚂蚁、甲鱼等；特殊的生物因子如胎盘因子、多肽等［2］。但这些成分原料来源有限或含量较低，又比如生物活性肽常常有苦味，将其作为日常饮食中的起到保肝作用的成分尚具有一定难度。有文献报道，将大鼠饮食中的酪蛋白替换为大豆分离蛋白（SPI）后，可显著降低酒精对肝脏的损害程度［3］。本研究采用四氯化碳致小鼠化学性急性肝损伤模型研究大豆蛋白的保肝作用，并考察大豆蛋白中7S、11S对保肝作用的贡献，这方面的研究目前鲜见报道；本研究旨在揭示大豆蛋白中具有保肝作用的活性因子，为后续开发蛋白类保肝食品提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

1.1.1 主要试剂及原料

大豆分离蛋白（蛋白质质量分数90.48%）：山东万得福实业集团；蛋白质标准品：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；四氯化碳（CCl4）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸钠（SDS）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺（Bis）、过硫酸铵（AP）、巯基乙醇、溴酚蓝、考马斯亮蓝R-250、TEMED等；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.2 仪器

PB-10 sartorius标准型pH计：德国赛多利斯股份公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：郑州长城科工贸有限公司；TDL-5A离心机：上海菲恰尔分析仪器有限公司；LGJ-12冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司；自动凯氏定氮仪：海能仪器股份有限公司；Multiskan Go全波长读数仪：Thermo scientific；DYY-8C电泳仪：北京市六一仪器厂。

1.1.3 溶液配制

PBS 浸提液：0.02 mol／L NaH2PO4，0.02 mol／L NaH2PO4，pH8.0。

分离胶缓冲液：18.17 gTris，0.4 gSDS 双蒸水溶解，调pH 至8.8，定容至100 mL。

浓缩胶缓冲液：6.06 gTris，0.4 gSDS 双蒸水溶解，调pH 至6.8，定容至100 mL。

Acr／Bis贮备液：30 gAcr，0.8 gBis 双蒸水溶解定容至100 mL。

样品缓冲液：双蒸水4 mL，0.5 mol／L Tris-HCl（pH 6.8）缓冲液1.0 mL，甘油0.8 mL，10%SDS 1.6 mL，巯基乙醇0.4 mL，0.1% 溴酚蓝0.2 mL，总体积8 mL，4 ℃保存。

染色液：1 g考马斯亮蓝R-250溶于250 mL甲醇及100 mL冰醋酸，溶解后定容至1 000 mL。

脱色液：10%醋酸。

1.2 方法

1.2.1 大豆分离蛋白中11S、7S的提取分离

参考大豆蛋白分离相关文献［4-6］，采用碱溶酸沉法对大豆分离蛋白中的11S，7S进行提取分离。主要步骤如下：将SPI与配置好的pH 8的PBS以1∶16（m／V）搅拌混匀，45℃浸提40 min，3 500 r／min 离心10 min，取上清，1 mol／L HCl调pH 至6.4，4℃冷沉12 h，3 500 r／min 离心10 min，沉淀即为11S。上清用1 mol／L HCl调节pH 至5.25，3 500 r／min 离心10 min，弃沉淀取上清，1 mol／L HCl调节pH 至4.8，3 500 r／min离心10 min，此时所得沉淀即为7S蛋白。采用SDS-PAGE 测定所得11S、7S 蛋白纯度［7］。

1.2.2 实验动物

试验采用清洁级昆明小鼠，雄性，体重（20±2）g，购自湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK（鄂）2008-0005。

1.2.2.1 大豆分离蛋白保肝作用

小鼠经1周适应性喂养后，将70只体重（20±2）g的昆明雄性小鼠随机分为7组，每组10只，分别为正常组、模型组、阳性对照（水飞蓟素）组、灌胃蛋白组、大豆蛋白饲料组（饲料中蛋白质全为SPI，占饲料比例为20%）。所有组均饮用自来水，除大豆蛋白饲料组外，其他均采用普通饲料饲养。灌胃量为10 mL／kg bw，正常组及模型组给予生理盐水（0.9%），阳性对照组按每日50 mg／kg bw灌胃水飞蓟素水溶液，给蛋白组中低、中、高剂量组分别按每日300、500、700 mg／kg bw灌胃大豆分离蛋白水溶液。连续给药15 d，于末次给药后2 h，正常组腹腔注射橄榄油，其余各组均腹腔注射0.15%CCl4橄榄油溶液，注射量均为10 mL／kg，注射后禁食不禁水，16 h后处死动物，取血液和肝脏，供后续试验用。

1.2.2.2 大豆分离蛋白中11S、7S 保肝作用

本次试验组共设10组，分别为正常组、模型组、阳性对照组、SPI组（700 mg／kg）、11S 蛋白和7S 蛋白低、中、高剂量组（300、500、700 mg／kg bw），处理方式同上。

1.2.3 血清及肝脏指标检测

按试剂盒说明书方法检测血清中ALT、AST活力，肝脏中MDA、GSH含量，GSH-Px活力，计算肝脏指数：肝脏指数＝肝脏质量（g）／体重（g）。

1.2.4 数据统计与分析

试验数据采用IBM SPSSstatistics 19进行单因素方差分析，Ducan氏多重比较，P＜0.05表示差异显著，结果以平均值±标准差（X±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 从大豆分离蛋白中分离11S、7S结果

大豆蛋白中的蛋白种类按沉降系数不同可分为4 类：2S、7S、11S、15S，它们所占比例分别为8%、35%、52%、5%［8］。其中SPI中7S蛋白和11S蛋白两者占了近90%；为了考察大豆蛋白中何者对保肝作用贡献大，本试验从SPI中分离出了7S蛋白和11S蛋白，凯氏定氮法［9］测得蛋白质量分数分别为91.82%和95.21%；为排除蛋白中多酚类物质对试验结果的影响，本试验测得灌胃所用蛋白中多酚含量［10］分别为0.371 mg／g 和0.377 mg／g，高剂量组小鼠每日随蛋白摄入的多酚（0.26 mg／kg bw）与报道有效剂量（150 mg／kg bw）［11］相比可以忽略；经SDS-PAGE电泳法检验所提取蛋白的纯度［12］，其纯度分别为91.20%和89.14% （见图1）。

图1 SPI中提取出的11S、7S蛋白SDS-PAGE图谱

2.2 大豆分离蛋白的保肝作用评价

由表1、表2可以看出，模型组与正常组相比，血清中ALT、AST活力，肝脏中MDA含量及肝脏指数显著升高（P＜0.05），而肝脏中GSH含量、GSH-Px活力显著降低（P＜0.05），说明造模成功。与模型组相比，公认的现已临床使用的水飞蓟素阳性对照组小鼠血清中ALT、AST活力，肝脏中MDA含量及肝脏指数显著降低（P＜0.05），而肝脏中GSH含量、GSH-Px活力明显升高（P＜0.05）。与模型组相比，大豆蛋白饲料组血清中ALT、AST活力，肝脏中MDA含量降低显著（P＜0.05），肝脏中GSH-Px活力显著升高（P＜0.05），6个指标均与阳性对照结果无显著差异，说明若将饮食中的蛋白全部替换为大豆分离蛋白，对化学性肝损伤有一定的拮抗作用。对于灌胃给SPI组，低剂量时，血清中酶活力，肝脏中GSH含量与模型组相比无显著差异；而中、高剂量组，血清中ALT、AST酶活力，肝脏中MDA、GSH含量、GSH-Px活力及肝脏指数与模型组相比有显著差异（P＜0.05），而高剂量各项指标均优于中剂量组，说明小鼠每天摄入700 mg／kg的SPI即可在一定程度上抵御化学性肝损伤。

表1 SPI对四氯化碳急性肝损伤小鼠血清中ALT、AST的影响

表2 SPI对四氯化碳急性肝损伤小鼠肝脏中MDA、GSH含量、GSH-Px活力和肝脏指数的影响

2.3 7S、11S蛋白的保肝作用评价

由表3、表4可知，与正常组相比，模型组血清中ALT、AST活力，肝脏中MDA含量及肝脏指数显著升高，肝脏中GSH含量、GSH-Px活力显著降低（P＜0.05）。与模型组相比，阳性对照组各指标均有显著改善，SPI组（700 mg／kg）各指标亦均有显著改善（P＜0.05），与阳性对照组结果相近或略逊于阳性对照组。

表3 11S、7S蛋白对四氯化碳急性肝损伤小鼠血清中ALT、AST活力的影响

表4 11S、7S蛋白对四氯化碳急性肝损伤小鼠肝脏中MDA、GSH含量、GSH-Px活力及肝脏指数的影响

与模型组相比，3个11S剂量对血清中ALT活力、肝脏中MDA含量无显著降低作用；但中、低剂量对血清中AST活力有显著降低作用（P＜0.05）；此外，中剂量组肝脏中的GSH含量、GSH-Px活力与模型组相比升高显著；高剂量只对GSH-Px活力有明显改善作用。与模型组相比，3组不同剂量的7S蛋白，低剂量组除能够显著降低肝脏中MDA含量外，对其他指标均无显著改善作用；中剂量能够显著降低血清中AST活力和肝脏中MDA、GSH含量，血清中ALT活力介于模型组和阳性对照组之间，但未达显著水平；而高剂量组各指标与模型组相比均有显著改善作用，且与SPI组相比，肝脏中MDA含量降低显著，GSH-Px活力显著升高。

3 讨论

大豆蛋白作为少数的含有人体所需全部氨基酸的植物蛋白，对其功能性质的研究历来已久，从大豆中含量极微的异黄酮到大豆蛋白，目前已报道的大豆蛋白的功能活性众多，如降低血清中胆固醇含量［13-14］、预防骨关节炎［15］、延缓肾病进程［16］、预防骨质疏松等作用。Yang等［3，17］研究了大豆蛋白对脂肪变性致肝损伤及酒精性肝损伤的影响，试验结果表明若饮食中的蛋白全由大豆蛋白提供，与模型组相比，肝脏各项指标均显著改善。

研究保肝作用常用血清转氨酶和肝脏相关指标进行评价。正常生理状态时，ALT和AST主要分布在肝脏的肝上皮细胞内，血清中含量极少。当肝脏受到四氯化碳损害时，四氯化碳在细胞色素P450作用下生成CCl3.，使肝上皮细胞受到破坏，ALT、AST被释放到血清中，导致血清中ALT、AST含量上升，其上升程度与肝脏所受的损伤程度一致，是目前最常用的肝功能指标［18］。此外，生成的自由基还能与细胞膜上的不饱和脂肪酸反应，引起脂质过氧化，MDA是这一反应过程的稳定产物，而体内的自由基急剧增加会消耗大量的SOD、GSH、GSH-Px等具有抗氧化功能的成分。所以，通过测定血清中ALT、AST活力，肝脏中MDA、GSH含量及GSH-Px活力，可以了解肝脏的受损情况。从本试验结果可以看出，SPI灌胃组中，高剂量组各指标改善作用优于低、中剂量组，其灌胃效果与每天食用SPI质量分数为20%饲料组相当，两组间各指标无显著差异；其GSH-Px活力指标甚至优于阳性对照组。这一结果与Yang等［3］在酒精性肝损伤模型中的结果一致。国内外对大豆蛋白的保肝作用研究大都采用大豆分离蛋白为研究对象，大豆蛋白中不同种类蛋白的保肝效果鲜见报道。为进一步探究SPI中不同蛋白的保肝作用，选取了700 mg／kg剂量的SPI作为对照，其中11S蛋白低、中、高剂量均不能改善ALT、MDA指标，说明11S虽为SPI中含量最高的成分，但其对保肝作用的贡献有限；而7S蛋白高、中、低剂量组中，低剂量组仅对MDA有显著改善作用，中剂量组对AST、MDA、GSH有显著改善作用，而高剂量对所有指标均有显著改善作用，说明7S蛋白对SPI保肝作用的贡献优于11S蛋白；并且存在剂量依赖关系。此外，与同剂量（700 mg／kg）的SPI组相比，7S蛋白组肝脏中GSH含量及GSH-Px活力显著升高，MDA显著降低（P＜0.05），提示7S蛋白是SPI中对保肝作用的主要贡献者。

在本试验中，每天给与小鼠700 mg／kg的大豆蛋白即可对四氯化碳引起的肝损伤起到拮抗作用。按摄入量小鼠∶人体（60 kg）＝9.01∶1 计算［19］，此剂量低于FDA推荐量25 g／d大豆蛋白，说明日常膳食中摄入少量大豆蛋白可有效减少化学物质对肝脏造成的损伤。

4 结论

700 mg／kg的大豆分离蛋白对四氯化碳致小鼠的化学性肝损伤具有拮抗作用，其中的7S蛋白是主要的保肝活性因子。

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Hepatoprotection of Soybean Protein Isolate and 7S，11SProteins

Liu Weiwei Ye Yuhui Hu Jun Nie Suping He Hui
（College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Key Laboratory of Environment Correlative Dietology，Ministry of Education，Wuhan 430070）

The present study was designed to investigate the hepatoprotective effect of soybean protein isolate（SPI）against carbon tetrachloride-induced damage in KunMing male mice.SPI and 11S，7Sproteins at a dose of

300，500，700 mg／kg was orally administered to mice，we also added a group of mice which was given SPI fodder（20%SPI was contained）for 15 days.On the last dose，0.15%of CCl4 （olive oil）were administered to mice followed last given drugs.The activity of alanine aminotransferase（ALT）and aspartate aminotransferase（AST）in serum，malondialdehyde（MDA）and glutathione（GSH）level，glutathione peroxidase（GSH-Px）activity in liver and liver index were determined.The result showed that pretreatment of mice with SPI（700 mg／kg）had significant hepatoprotection against CCl4-induced liver damage.Compared with CCl4model group，7Ssoy protein （700 mg／kg）reduced the activity of ALT，AST in serum and the MDA level in liver，and improved GSH level and GSH-Px activity significantly （P ＜0.05）.Our findings suggested that SPI could be a candidate used for preventing liver damage induced by chemicals and 7Ssoy protein was main hepatoprotective activity contributor.

soybean protein isolates （SPI），7S soy protein，11S soy protein，carbon tetrachloride （CCl4），hepatoprotection

TS218

A

1003-0174（2016）11-0032-06

863计划（2013AA102206）

2015-03-03

刘维维，女，1992年出生，博士，食品科学

何慧，女，1960年出生，教授，食品化学