母婴分离致肠易激综合征大鼠模型的建立与评价

2016-12-26 02:57滕卫军杜小雪丁明星陈浩浩方远书
浙江医学 2016年6期
关键词:背角内脏母婴

滕卫军 杜小雪 丁明星 陈浩浩 方远书

母婴分离致肠易激综合征大鼠模型的建立与评价

滕卫军 杜小雪 丁明星 陈浩浩 方远书

目的 研究新生期母婴分离导致肠易激综合征(IBS)大鼠模型的建立及其对P物质与其受体NK1表达的影响。 方法 将64只新生期雄性大鼠随机分为母婴分离组(在出生后第2~21天,每天将新生大鼠与哺乳期母鼠分离3h)和对照组(不给予上述处理)。成年后(出生后60d)两组大鼠均给予结直肠球囊扩张(CRD),用行为学观察和腹部回缩反射(AWR)评分来评估内脏痛反应,用免疫组化方法检测腰骶段脊髓背角P物质及其受体NK1的表达量,并进行远端结肠常规组织学检测。结果 引起母婴分离组大鼠内脏痛反应的CRD压力阈值[(19.22±9.26)mmHg]显著低于对照组[(24.89±10.91)mmHg],差异有统计学意义(P<0.05)。在40、60和80mmHg压力扩张下,母婴分离组的AWR评分均显著高于对照组(均P<0.05)。CRD后母婴分离组腰骶段脊髓背角P物质及其受体NK1蛋白免疫反应阳性细胞数与对照组比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。母婴分离组和对照组大鼠在CRD前后结肠均未见组织损伤或炎症。结论 新生期母婴分离能成功建立IBS大鼠模型,成年后在内脏刺激时产生过强的内脏痛反应和神经元活化反应,P物质及其受体NK1可能不参与其过程。

肠易激综合征 新生期母婴分离 P物质 NK1受体

肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是临床上最常见的功能性肠病,内脏感觉过敏是IBS病理生理特征之一,但确切机制依然不明[1],因而建立合适的动物模型极为必要。研究发现,母婴分离大鼠模型具有内脏痛觉过敏和应激后结肠运动加强,能较好模拟IBS患者的主要特征[2-3]。新生期母婴分离对大鼠是一种早期生活事件,该大鼠模型成年后应激反应加强,这和部分IBS患者有早期生活事件病史以及应激反应加强的特点相似。本研究采用新生期母婴分离方法建立IBS模型,检测其内脏敏感性和感觉神经通路神经元活化及P物质与受体NK1的影响,旨在为探索IBS内脏感觉过敏的机制提供依据,现报道如下。

1 材料和方法

1.1 动物分组 将出生后第1天的64只Sprague-Dawley雄性大鼠(由金华市实验动物中心提供,许可证号SYXK(浙)2010-0151)分为8笼,每笼8只,每笼分配1只哺乳期母鼠。按随机数字表法分为两组:母婴分离组和对照组(各32只),每组各4笼。母婴分离组在出生后第2~21天,每天将新生大鼠与哺乳期母鼠分离3h;对照组在出生后第2~21天,不给予任何处理。饲养环境:每周半量换木屑垫料,出生后第22天断奶,第30天分笼,每笼4只大鼠。昼-夜循环周期为12:12h(6:00开灯,18:00关灯),自由饮水饮食,室温(20±1)℃。直到出生后第60天(体重280~320g)再进行其它操作。所有的实验程序按照实验动物中心的批准协议进行。

1.2 新生期母婴分离 根据Coutinho和Tjong等[2-3]报道的方法略有调整,具体操作如下:9:00开始,将哺乳期母鼠从笼中拎出放入另一个单独的笼中;然后将新生大鼠作为一个整群(每群8只)从笼中移出,放入另一个单独的笼中(笼内铺有3cm厚的木屑垫料),再将此笼转移到隔壁房间,室温为(20±1)℃;3h后,将新生大鼠反回最初笼中,使之在垫料上翻滚,然后将哺乳期母鼠放回,使母婴团聚。

1.3 结直肠球囊扩张(colorectal distension,CRD)及行为学评估内脏敏感性 大鼠成年后(出生后60d)进行CRD:大鼠经2%异氟醚(含氧量为0.2L/min)麻醉后,将石蜡油润滑后的带气囊的8F导尿管经肛门插入约6cm,用胶带纸将导管缠绕固定在大鼠尾根部,导管经三通管连接10ml注射器和汞柱式血压计,使球囊内压力(代表结直肠内压力)得以实时监控。然后将大鼠放在塑料平台上(30cm×20cm),使之苏醒并适应环境30min后,快速注气使球囊压力达到10mmHg,维持此压力20s,然后抽出气体使球囊内压力降到0,4min后重复上述扩张过程,再同理依次分别给予20、40、60和80mmHg扩张压力。CRD是一种机械性内脏刺激,可引起大鼠内脏运动反应-腹部回缩反射(abdominal withdrawal reflex,AWR),即腹部和后肢肌肉的收缩。AWR可用一个半定量评分系统来评估[4],1分:结直肠扩张期间身体静止不动,扩张初始偶有头部扭动;2分:腹部肌肉轻微收缩,但腹部未抬离平台面;3分:腹部肌肉明显收缩,腹部抬离平台面;4分:腹部肌肉强烈收缩,身体呈拱形,腹部和骨盆结构均抬离平台面。取每个压力强度下的2次AWR评分的均值作为该压力强度下的AWR评分。观察两组引起明显的内脏运动反应即可观察到的腹部肌肉收缩(AWR评分2分)所需要的压力阈值。每只大鼠的CRD持续时间由计时器严格控制。大鼠的行为学评估由一位观察者独立完成,该观察者对大鼠的分组及处理不知情。

1.4 脊髓背角SP蛋白及NK1受体表达的检测 取腰骶段脊髓(L6~S1)后固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液,进行脊髓切片的免疫荧光标记方法,步骤如下:漂洗切片于0.01mol/L的PBS缓冲液中,2×10min;孵育切片于包含0.3%Triton x-100和10%正常山羊血清的PBS缓冲液中,30min;去除上述阻断液(不要漂洗);孵育切片于一抗溶液中(小鼠抗大鼠P物质抗体,购自abcam公司,稀释度为1∶500;兔抗大鼠NK1受体抗体,购自Sigma公司,稀释度为1∶200,均稀释于含0.3%Triton x-100和5%正常山羊血清的PBS缓冲液中)室温下过夜;漂洗切片于0.01mol/L的PBS缓冲液中,3×10min;分别孵育切片于不同二抗溶液中(FITC标记的兔抗小鼠IgG抗体,TRITC标记的山羊抗兔IgG抗体,购自Sigma公司,稀释度为1∶500,稀释于含0.3%Triton x-100和5%正常或兔山羊血清的PBS缓冲液中)室温下2h;漂洗切片于0.01mol/L的PBS缓冲液中,3×10min;将切片用50%甘油(甘油和PBS缓冲液等体积混合)裱于经APES处理过的载玻片上,盖上盖玻片。免疫标记后,切片用Zeiss Axiophot 2显微镜观察,用数码相机及其配套软件Spot 32摄取图像,FITC和PE在激发下分别发出绿光和红光,图像获得后,用Metamorph4.0软件进行图像定量分析。P物质在脊髓背角的阳性面积:在10×物镜视野下获取整个脊髓背角或中脑的图像,用Metamorph4.0软件进行分析,设置灰度阈值,超过此阈值的灰度被确定为阳性,得到双侧背角P物质阳性面积,结果表示为μm2/双侧背角。NK1受体在脊髓背角或中脑的表达:NK1受体免疫反应在脊髓背角的分布范围用半定量评分来衡量,因为NK1免疫反应分布于Ⅰ层、Ⅲ~Ⅴ层、靠近中央管的Ⅹ层[5],设定评分标准为1分:一个区域有免疫反应;2分:两个区域有免疫反应;3分:三个区域有免疫反应;4分:更多区域有免疫反应。所有分析由一位对实验分组和处理情况不知情的分析者完成。

1.5 结肠组织学观察 结直肠扩张后,取大鼠远端结肠(距肛门5~6cm)固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中,置于4℃冰箱中过夜,经梯度乙醇脱水、二甲苯透明和浸腊包埋,切片(厚5μm)进行常规HE染色,观察肠壁炎症和损伤情况。

1.6 统计学处理 采用SPSS18.0统计软件,测得计量资料采用表示,多组均数间的比较采用方差分析,行为学结果即压力阈值和AWR评分用Mann-Whitney U非参数检验分析。

2 结果

2.1 两组大鼠对CRD的压力阈值以及不同压力CRD的AWR评分比较 见表1。

表1 两组大鼠对CRD的压力阈值以及不同压力CRD的AWR评分比较

由表1可见,母婴分离组的引起明显的内脏运动反应即可观察到的腹部肌肉收缩(AWR评分2分)所需要的压力阈值显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。在10和20mmHg压力扩张下,母婴分离组的AWR评分和对照组无统计学差异(均P>0.05);而在40、60和80mmHg压力扩张下,母婴分离组的AWR评分显著高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。

2.2 腰骶段脊髓背角SP和NK1P物质免疫反应分布和表达 P物质免疫反应分布于脊髓背角浅层(图1)。定量分析发现,母婴分离组和对照组在CRD前后,脊髓背角P物质阳性面积均无统计学差异(均P>0.05)(表2)。NK1受体在脊髓背角广泛分布,浓集分布于浅层,在深层和靠近中央管区域有阳性神经元和突起(图2)。定量分析发现,母婴分离组和对照组在CRD前后,脊髓背角NK1受体分布积分均无统计学差异(均P>0.05),见表2。

图1 P物质免疫反应在脊髓背角的分布和表达

图2 NK1受体免疫反应在脊髓背角的分布和表达

表2 母婴分离组和对照组脊髓背角SP和NK1受体的表达

2.3 结肠组织学观察 母婴分离组和对照组在CRD前后,均未见明显组织损伤,亦未见中性粒细胞等炎性细胞浸润(图3、4)。

图3 母婴分离组结肠病理检查所见(HE染色,×200)

图4 对照组结肠病理检查所见(HE染色,×200)

3 讨论

本研究证实新生期母婴分离大鼠模型具有内脏痛觉过敏应激后结肠运动加强,能较好模拟IBS患者的主要特征。早期生活应激原如童年被忽视、受虐待、失去父母等事件能增加IBS发生的危险性[6]。新生期母婴分离是一种明确的早期生活事件,可致幼鼠中枢应激环路的永久改变和应激反应加强[7],内脏感觉过敏[8],这和部分IBS患者有早期生活事件病史以及应激反应加强的特点相似。

本研究还发现,母婴分离组大鼠在更低的CRD压力刺激下即可产生明显的内脏运动反应,且母婴分离组的AWR评分显著高于对照组,说明成年后在内脏刺激时产生过强的内脏痛反应和神经元活化反应,但SP及其NK1受体与其无关。Ren等[9]用行为学观察来半定量检测结直肠扩张时内脏敏感性,同时以用腹部肌肉逐级收缩,AWR的数字评分来量化,随刺激强度的增加而增加,用于检测大鼠内脏传入信息加工处理的改变,证明母婴分离大鼠有内脏痛觉过敏。尽管P物质和NK1受体在炎症时内脏痛传输和调节方面起重要作用[10],但本实验检测了内脏伤害性刺激(CRD)时脊髓及中脑水平P物质和NK1受体的分布和表达时,未能发现有统计学差异,提示在母婴分离致IBS内脏高敏对脊髓P物质的释放和NK1受体的激活影响不大,也可能与IBS大鼠结肠本身炎症不明显有关,有待进一步研究。最近发现感染后IBS患者结肠黏膜P物质表达增加,而非感染感染后IBS患者结肠黏膜P物质表达与对照组无统计学差异[11],支持我们的结果。本实验大鼠结肠组织学结果发现,母婴分离组和对照组大鼠肠道在CRD前后均没有损伤和炎症的改变,这与IBS缺乏病理学改变的特点相符合。

总之,本实验使用容易获得的SD大鼠,经新生期母婴分离方法建立模型,检测发现该大鼠模型内脏运动反应和脊髓背角神经元反应均较对照组大鼠显著增加,但SP及其NK1受体表达不受影响,证实其具有内脏感觉过敏,而且不伴有肠道病理改变,符合IBS内脏感觉过敏的特点。

[1] Hungin A P,Becher A,Cayley B,et al.Irritable bowel syndrome: an integrated explanatory model for clinical practice[J].NeurogastroenterolMotil,2015,27(6):750-763.

[2] Coutinho S V,Plotsky P M,Sablad M,et al.Neonatal maternal separation alters stress-induced responses to viscerosomatic nociceptive stimuliin rat[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2002,282(2):G307-316.

[3] Tjong YW,Ip S P,Lao L,et al.Role of neuronal nitric oxide synthase in colonic distension-induced hyperalgesia in distal colon of neonatal maternal separated male rats[J].Neurogastroenterol Motil,2011,23(7):666-e278.

[4] Al-Chaer E D,Kawasaki M,Pasricha P J.A new model of chronic visceral hypersensitivity in adult rats induced by colon irritation during postnatal development[J].Gastroenterology,2000,119(5): 1276-1285.

[5] Kozlowski C M,Green A,Grundy D,et al.The 5-HT(3)receptor antagonist alosetron inhibits the colorectaldistention induced depressor response and spinal c-fos expression in the anaesthetised rat[J].Gut,2000,46(4):474-480.

[6] O'Mahony S M,Hyland N P,Dinan T G,et al.Maternal separation as a modelof brain-gut axis dysfunction[J].Psychopharmacology(Berl),2011,214(1):71-88.

[7] Slotten H A,Kalinichev M,Hagan J J,et al.Long-lasting changes in behavioural and neuroendocrine indices in the rat following neonatalmaternalseparation:gender-dependent effects[J].Brain Res,2006,1097(1):123-132.

[8] 林剑,王承党.早期母婴分离对成年大鼠内脏感觉和肠道炎症的影响[J].胃肠病学,2013,18(3):154-158.

[9] Ren T H,Wu J,Yew D,et al.Effects of neonatal maternal separation on neurochemicaland sensory response to colonic distension in a ratmodelofirritable bowelsyndrome[J].Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol,2007,292(3):G849-G856.

[10] Saban R,Simpson C,Vadigepalli R,et al.Bladder inflammatory transcriptome in response to tachykinins:neurokinin 1 receptor-dependent genes and transcription regulatory elements[J]. BMC Urol,2007,7:7.

[11] 魏良洲,鞠辉,戴素美,等.感染后肠易激综合征患者结肠黏膜P物质与白细胞介素、干扰素表达的相关性研究[J].中华消化杂志,2006,26 (9):586-589.

(本文编辑:沈昱平)

《浙江医学》“病例讨论”栏目征稿

根据广大读者的建议,本刊开辟了“病例讨论”栏目,论文结构分为“病例摘要”和“讨论”两部分,以期通过对疑难、复杂或罕见病例的介绍和讨论,交流临床工作经验,帮助广大临床医师掌握科学的临床思维方式,提高各专科和多学科的综合分析判断能力,进而提高医疗水平。现特向广大临床医师征集相关病例,具体要求如下。

1病例选择(1)疑难病例,特别是涉及多学科、多领域的疑难病例;(2)诊断明确,但病情危重和(或)治疗棘手的病例;(3)临床较罕见的病例。以上病例均需最终获得明确诊断或成功治疗,且临床资料齐全,并能提供实验室、影像学和(或)病理确诊依据。

2写作格式和要求 (1)病历摘要:分段叙述患者的简要病史(包括主诉、现病史、既往史等)、入院后体检情况、辅助检查结果、入院后治疗方案及病情变化等内容;(2)讨论:分段记录各级或各科或各院医师对该病例的特点、诊断、鉴别诊断、进一步辅助检查和治疗方案等方面的分析,若为罕见病,则需介绍目前国内外关于该病诊治方面的最新进展;(3)列出相关的国内外主要参考文献;(4)全文字数在3 000字左右。

3投稿注意事项 投稿时请务必在稿件末页留下第一作者手机号码和电子邮箱地址,同时附上单位证明(证明该病例所有资料属实,无一稿两投,无涉及保密等情况)。

本刊编辑部

Establishment of irritable bowel syndrome rat models with neonatal maternal separation method


TENG Weijun,DY Xiaoxue,DING Mingxing,et al.Department of Gastroenterology,Jinhua Hospital of Zhejiang University,Jinhua 321000,China

Objective To establish a rat model of irritable bowel syndrome with neonatal maternal separation method. Methods Male neonatal SD rats were randomly divided into 2 groups:in maternal separation(MS)group,the rats were exposed to a 3-h daily maternal separation from d2 to d21,and rats in control group were not exposed to maternal separation.The colorectal balloon distension(CRD)was performed 60d after birth for assessment of abdominal withdrawal reflex(AWR),a surrogate marker of visceral pain.Lumbar-sacral spinal cords were harvested for semi-quantitative analysis of substance (SP)and its receptor NK1 in the dorsal horn using immunohistochemical methods.The distal colons were examined with histological analysis before and after CRD. Results Pain threshold was significantly lower in MS than that in control group(19.22±9.26mmHg vs.24.89± 10.91mmHg,P<0.05).The AWR score in response to CRD in MS group was significantly higher than control group at high distension pressures(40 mmHg:3.49±1.40 vs.2.80±1.34;60 mmHg:3.78±1.11 vs.3.16±1.21;80 mmHg:4.26±1.35 vs. 3.61±1.01;P<0.05).There was no significant difference in the number of SP and NK1 receptor-positive neuron at dorsal horn of lumbar-sacral spinal between MS and control group(38.07±9.21 vs.39.85±8.29;2.26±0.54 vs.2.63±0.79,P>0.05)after CRD.There was no tissue injury or inflammation in distal colon both in MS and control groups before and after CRD. Conclusion Prior neonatal maternal separation stress predisposes rats to exaggerated neurochemical responses and visceral hyperalgesia in adulthood without inducing structural alterations in colon,which mimic the features of visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome,and SP and its NK1 receptor may be not involved in the process.

Irritable bowelsyndrome Neonatalmaternalseparation Substance P(SP)NK1 receptor

2015-11-11)

浙江省科技厅实验动物科技计划项目(2013C37032)

321000 浙江大学金华医院消化科(滕卫军);浙江大学神经科学研究所(杜小雪);金华职业技术学院医学院(丁明星、陈浩浩);金华市实验动物中心(方远书)

猜你喜欢
背角内脏母婴
神经病理性疼痛的新机制:脊髓背角氯离子失衡导致5-HT 下行抑制作用转变为易化作用
非典型内脏异位综合征1例
空心猪
多发内脏动脉瘤合并右侧髂总动脉瘤样扩张1例
好吃的内脏
点亮婴儿房,母婴灯具搜集
独一味对糖尿病痛大鼠脊髓背角内胶质细胞激活的影响
喜忧参半的母婴产品“海淘热”
在神经病理性疼痛大鼠中脊髓背角III层甘氨酸能神经元投射至II层放射状神经元的抑制性环路发生功能障碍
尿布师:只卖纸尿裤的母婴电商