PTEN基因表达与腮腺多形性腺瘤的发生发展的关系

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(1.武汉大学人民医院口腔科,湖北 武汉 430060;2.武汉大学口腔医院)

·临床医学·

PTEN基因表达与腮腺多形性腺瘤的发生发展的关系

刘志明1，张虹2，黄丽1，张周文1，彭友俭1

(1.武汉大学人民医院口腔科,湖北 武汉 430060;2.武汉大学口腔医院)

目的分析PTEN基因表达与腮腺多形性腺瘤的发生发展的关系。方法选取本院口腔科收治的腮腺多形性腺瘤25例，同时选取正常腮腺组织20例作为对照，分别采集腮腺多形性腺瘤患者的腺瘤组织、瘤旁0.5 cm～2 cm组织、舌下腺组织，以及正常对照的腮腺组织，比较不同组织中PTEN mRNA及蛋白的表达差异；比较复发组、未复发组和正常腮腺组织中PTEN mRNA及蛋白的表达差异。结果腺瘤组织、瘤旁0.5 cm组织、瘤旁1 cm组织、瘤旁1.5 cm组织中PTEN mRNA表达均低于正常腺体组织和舌下腺组织；腺瘤组织(56.0%)和瘤旁0.5 cm组织(64.0%)中PTEN蛋白表达阳性率均低于正常腺体组织(100.0%)和舌下腺组织(96.0%)；复发组腺瘤组织中PTEN mRNA表达(0.413±0.052)均低于正常腺体组织(0.947±0.061)和未复发组腺瘤组织(0.639±0.058)；复发组腺瘤组织中PTEN蛋白表达阳性率(27.3%)均低于正常腺体组织(100.0%)和未复发组腺瘤组织(71.4%)(P均<0.05)。结论腮腺多形性腺瘤组织中的PTEN表达低于正常腮腺和舌下腺组织，复发组腺瘤组织中的PTEN表达低于未复发组和正常组。

腮腺多形性腺瘤； PTEN mRNA； PTEN蛋白； 复发

腮腺多形性腺瘤作为一种常见上皮病变性良性肿瘤,其具有多种病理形态[1]，且瘤体成分复杂，其中包含有上皮组织、皮下粘液和胶质[2]，造成其具有较高侵袭性及复发性，能够恶化成为恶性肿瘤[3]。既往研究显示，腮腺多形性腺瘤转变为恶性肿瘤和基因异变具有相关性，但关于具体何种基因决定其生长及恶化[4]，医学界仍处于争论中。

PTEN作为新发现一种肿瘤抑制基因，存在于人10号染色体上，其能够抑制特异性磷酸酶活性，从而实现抑癌功效[5]。文献称，PTEN参与和影响多种恶性肿瘤发生、发展，并能显著调控细胞凋亡及迁移[6]，故笔者选择选取本院口腔科收治的25例腮腺多形性腺瘤标本作为研究对象，旨在探讨PTEN表达和腮腺多形性腺瘤生长及恶化间相关性。现将研究结果总结如下。

1 资料与方法

1.1一般资料选取本院口腔科收治的腮腺多形性腺瘤25例，其中男性17例，女性8例，年龄29～65岁，平均年龄(42.34±7.85)岁，其中复发性腮腺多形性腺瘤11例，其中男性7例，女性4例，年龄32～63岁，平均年龄(41.42±7.43)岁，复发时间2.8～7.2年，平均(4.29±1.45)年；未复发腮腺多形性腺瘤14例，其中男性10例，女性4例，年龄30～65岁，平均年龄(42.62±7.32)岁；同时选取正常腮腺组织20例作为对照，其中男性14例，女性6例，年龄30～65岁，平均年龄(42.59±7.18)岁。病例组和对照，复发和未复发组在年龄上无显著差异(P>0.05)。

1.2纳入排除标准

1.2.1 病例纳入标准[7](1)经两位有经验的医生读取病理切片确诊的腮腺多形性腺瘤患者。(2)符合医学伦理，并且和研究对象签订了知情同意书。

对照纳入标准：(1)选取具有可比性的对照，并采集腮腺组织。(2)符合医学伦理，并且和研究对象签订了知情同意书[8]。

1.2.2 排除标准 (1)病理标本保存不完整的患者。(2)不愿参与研究的研究对象。

1.3检测方法

1.3.1 PTEN mRNA检测方法 兔抗人PTEN多克隆抗体(工作浓度1∶50)购自美国Abcam公司，SP免疫组化试剂盒购自上海研卉生物科技有限公司。釆用Trizol法提取组织总PTEN mRNA。取出-70 ℃冷存下100 mg胰腺多形性腺瘤与正常涎腺组织分别提取其总RNA，滴入1 mL Trizol放有提取组织玻璃匀浆器内，并于冰上充分匀浆。后将10 mL浆液体置于DEPC处理后EP管内，室温下静置5 min。滴入5 mL氯仿，充分混匀，室温下静置3 min。4 ℃、4 000 rpm离心5 min。弃上清液，滴入1 mL DEPC水配制75%乙醇，4 ℃、3 200 rpm离心5 min，弃上清液，晾干、滴入20 μL DEPC水，加热至60 ℃促溶10 min，-25 ℃冷存。波长260 nm分光测定mRNA表达，OD取值1，在光路中，n倍稀释样品选择ddH2O，双蒸水作为空白对照，读出OD260值，稀释前样品浓度：RNA=40×OD260值×稀释倍数n/1 000，RNA浓度=OD260值×2.4。PCR法检测mRNA，反应体系：2 μL dNTP Mixture，4 μL MgCl2，0.5 μL RNasin，2 μL 10×buffer，0.75 μL反转录酶，1 μL Oligo DT引物，8～20 μL ddH2O。反应条件：45 ℃ 60 min，95℃ 5 min，5℃5min。上游引物序列：5′-AGATGGGTCTATGTTGTCCAGG-3′，下游引物序列：5′-GGGTGCAGTAATGACATTGTGG-3′，扩增片断长度为220 bp。扩增体系：1 μL dNTP Mixture，2 μL cDNA，5 μL 10×PCR buffer，上、下游引物各1.25 μL，0.25 μL反转录酶，35～50 μLddH2O，3.7 μL MgCl2。

反应条件：94 ℃ 预变5 min，94 ℃ 变性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，72 ℃终末延伸5 min，共36个循环，5 ℃保温。2.0%琼脂糖凝胶电凝，凝胶图象分析仪检测分析PTEN mRNA，bp值和产物电泳条带数量。

1.3.2 PTEN蛋白检测方法 免疫组织化学测定PTEN蛋白，取多形性腺瘤与正常涎腺组织常规制备石蜡标本后切成厚度为3～4 μm切片，后将切片置于多聚赖氨酸处理后玻片上，并对其行二甲苯脱蜡、梯度酒精水化，放入PBS洗3次，5 min/次，3%H2O2滴入切片玻片上，静置30 min，PBS洗3次，5 min/次。滴加山羊血清封闭液，于室温下反应20 min，甩去多余液体。滴入50 μL兔抗人PTEN多克隆抗体作为一抗，室温条件下静置1h，置于4℃过夜后，37℃复温30 min。PBS洗3次，5 min/次，滴入50 μL辣根过氧化物酶标记的链亲和素作为二抗，室温静置30 min，PBS洗3次，5 min/次，DAB显色5 min，显微镜观察及掌握染色程度，取出自来水冲洗5 min，苏木精复染5 min，盐酸酒精分化，常规脱水、透明及封片，置于光镜下检查。

1.4观察指标和检查方法分别采集腮腺多形性腺瘤患者的腺瘤组织、瘤旁0.5 cm组织、瘤旁1 cm组织、瘤旁1.5 cm组织、瘤旁2 cm组织、舌下腺组织，以及正常对照的腮腺组织，比较不同组织中PTEN mRNA、PTEN蛋白的表达差异；比较复发组、未复发组和正常腮腺组织中PTEN mRNA及蛋白的表达差异。

2 结 果

2.1正常腺体组织、腮腺多形性腺瘤与舌下腺组织中PTEN mRNA表达比较腺瘤组织、瘤旁0.5 cm组织、瘤旁1 cm组织、瘤旁1.5 cm组织中PTEN mRNA表达均低于正常腺体组织(P<0.05)；腺瘤组织、瘤旁0.5 cm组织、瘤旁1 cm组织、瘤旁1.5 cm组织中PTEN mRNA表达均低于舌下腺组织(P<0.05)；瘤旁2 cm组织中PTEN mRNA表达与正常腺体组织和舌下腺组织无显著性差异(P>0.05)。见表1。

表1正常腺体组织、腮腺多形性腺瘤与舌下腺组织中PTENmRNA表达比较

组别例数PTENmRNA表达(相对密度值)正常腺体组织200．947±0．061腺瘤组织250．556±0．053ab瘤旁0．5cm组织250．598±0．057ab瘤旁1cm组织250．621±0．051ab瘤旁1．5cm组织250．785±0．049ab瘤旁2cm组织250．802±0．055舌下腺组织250．916±0．072

与正常腺体组织比较，a：P<0.05；与舌下腺组织比较b：P<0.05

2.2正常腺体组织、腮腺多形性腺瘤与舌下腺组织中PTEN蛋白表达比较腺瘤组织(56.0%)和瘤旁0.5 cm组织(64.0%)中PTEN蛋白表达阳性率均低于正常腺体组织(100.0%)和舌下腺组织(96.0%)(P<0.05)；瘤旁1 cm组织、瘤旁1.5 cm组织、瘤旁2 cm组织中PTEN蛋白表达阳性率与正常腺体组织和舌下腺组织无显著性差异(P>0.05)。见表2。

表2正常腺体组织、腮腺多形性腺瘤与舌下腺组织中PTEN蛋白表达比较

组别例数阴性阳性阳性率(%)正常腺体组织20020100．0腺瘤组织25111456．0ab瘤旁0．5cm组织2591664．0ab瘤旁1cm组织2542184．0瘤旁1．5cm组织2532288．0瘤旁2cm组织2512496．0舌下腺组织2512496．0

与正常腺体组织比较，a：P<0.05；与舌下腺组织比较b：P<0.05

图1 免疫组织化学测定PTEN蛋白 A:多形性腺瘤组织；B:瘤旁组织；C:舌下腺组织；D:正常腺体组织

2.3复发组腮腺多形性腺瘤组织与未复发组和正常腺体组织的PTEN mRNA表达比较复发组腺瘤组织中PTEN mRNA表达(0.413±0.052)均低于正常腺体组织(0.947±0.061)和未复发组腺瘤组织(0.639±0.058)(P<0.05)。

表3复发组腮腺多形性腺瘤组织与未复发组和正常腺体组织的PTENmRNA表达比较

组别例数PTENmRNA表达(相对密度值)正常腺体组织200．947±0．061未复发组腺瘤组织140．639±0．058a复发组腺瘤组织110．413±0．052ab

与正常腺体组织比较，a：P<0.05；与未复发组腺瘤组织；b：P<0.05

3 讨 论

PTEN作为一种人类基因，其主要位于人染色体10q23片段同源丢失区上[8]。该基因由八个内含子和九个外显子组成，其生理结构可分为一个脂质结合C2区、一个由五十个氨基酸组成的羧基端域和一个氨基端磷酸酶域[9]。PTEN生理功能主要通过氨基端产生，能够介导和参与调控人体多种信息传导途径，并影响细胞凋亡[10]。此外，该基因的羧基端区属于基因性癌变易发、高发区,因此，抗癌领域常选择该区作为肿瘤病变检测的主要靶区之一。

通过参阅资料可知，PTEN突变或基因片段病理性缺失能够诱发多种癌症这是因为PTEN能够调控人体细胞周期[11]，对P21、P27和P51等细胞周期素依赖激酶抑制因子产生特异性影响，显著调控细胞生长、增殖；PTEN还能促使PIP3脱磷酸化，造成受PI3K调控的细胞生长因子信号传输通路被阻断，维持正常细胞生长周期；而PTEN缺失可致PIP3过表达，诱发其下游各类信号分子活性增强，产生级联反应促使细胞病变转化，此外PTEN显著增高，直接造成细胞阻滞于G1期，无法向S期进阶，增强细胞病变可能性[12]。文献称，PTEN,缺失或失活能够诱发腮腺多形性肿瘤产生、发展，而其表达水平和腮腺多形性肿瘤生长及预后具有密切关系[13]。

在本文中，我们通过分别检测腮腺多形性腺瘤和正常腮腺组织内PTEN mRNA表达水平，结果显示腺瘤组织、瘤旁0.5 cm组织、瘤旁1 cm组织、瘤旁1.5 cm组织内PTEN mRNA表达均低于正常腺体组织(P<0.05)；而腺瘤组织、瘤旁0.5 cm组织、瘤旁1 cm组织、瘤旁1.5 cm组织中PTEN mRNA表达均低于舌下腺组织(P<0.05)；瘤旁2 cm组织中PTEN mRNA表达与正常腺体组织和舌下腺组织无显著性差异(P>0.05)，这表明PTEN表达增高可能是诱发腮腺多形性肿瘤发生、发展的相关因素，且该基因表达水平还能评估癌变组织恶性程度，可能影响肿瘤细胞生长、增殖及向远处侵润、迁移，肿瘤组织恶性和分化程度越高，其表达水平越高。在研究中，我们通过对腮腺多形性腺瘤和正常腮腺组织内PTEN蛋白表达进行免疫组织化学测定，结果显示腺瘤组织和瘤旁0.5 cm组织内PTEN蛋白表达阳性率均低于正常腺体组织及舌下腺组织，且差异均具有统计学意义(P<0.05)；瘤旁1 cm组织、瘤旁1.5 cm组织、瘤旁2 cm组织中PTEN蛋白表达阳性率与正常腺体组织和舌下腺组织无显著性差异(P>0.05)。这表明PTEN由于腮腺多形性腺瘤而造成其蛋白阳性表达率上升，而瘤旁1 cm腺体组织蛋白表达率接近于腮腺组织，这表明恶性程度越高，PTEN蛋白表达越低。在研究中，我们发现舌下腺组织PTEN基因和蛋白和正常正常腮腺组织相近，这是因为该组织标本来自舌下腺导管堵塞、涎液漪留形成囊肿，其虽属于炎性病变组织，但无基因异变，因此其PTEN基因和蛋白均无异变。

PTEN基因及蛋白表达和腮腺多形性腺瘤预后具有相关性，可通过检测PTEN对患者预后进行评估、判断[14]。在本研究中，复发组腺瘤组织中PTEN mRNA表达、PTEN蛋白表达阳性均低于正常腺体组织和未复发组腺瘤组织(P<0.05)，这表明PTEN不仅和腮腺多形性腺瘤发生、发展具有相关性，同时也能决定其远期复发，我们认为若采取措施增强PTEN表达，能够有效抑制腮腺多形性腺瘤生长，并显著降低患者远期复发。

综上所述，PTEN低表达和腮腺多形性腺瘤生长及发展具有相关性，并能决定其复发，能够影响患者预后。

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TheRelationshipBetweenPTENGeneExpressionandtheDevelopmentofParotidGlandPolymorphicAdenoma

LIU Zhiming， ZHANG Hong，HUANG Li，et al
(StomatologyCenter,RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060China)

ObjectiveTo analyze the relationship between PTEN gene expression and the development of parotid gland polymorphic adenoma.Methods25 cases of parotid gland polymorphic adenoma were selected in our hospital’s department of Stomatology,and 20 cases of normal parotid gland were selected as control group,pleomorphic adenoma of parotid adenoma tissues,0.5 cm～2 cm of tumor adjacent tissues,sublingual gland,and normal salivary gland tissue were collected,to compare the expressions of PTEN mRNA and PTEN protein in different tissues;and the expression of PTEN mRNA and PTEN protein in the recurrent group,the non-recurrence group and the normal parotid gland were compared.Results

The PTEN mRNA expression of adenoma tissues,0.5 cm of tumor adjacent tissue,1 cm of tumor adjacent tissue,1.5 cm of tumor adjacent tissue was significantly lower than that of normal glandular tissue and sublingual gland tissue.The PTEN protein expression positive rate of adenoma (56%) and 0.5 cm of tumor adjacent tissue(64%) was significantly lower than that of normal glandular tissue (100%) and sublingual gland (96%);The expression of PTEN mRNA in the recurrent group (0.413±0.052) was significantly lower than that in normal tissues (0.947±0.061) and the non-recurrent group (0.639±0.058);The positive expression rate of PTEN protein in recurrent group (27.3%) was significantly lower than that of normal gland tissues (100%) and non-recurrence group (71.4%) (allP<0.05).ConclusionThe expression of PTEN in the tissues of parotid gland was lower than that of normal parotid gland and sublingual gland tissues,and in recurrent group was lower than that in normal groupand non-recurrence group.

parotid gland polymorphic adenoma; PTEN mRNA; PTEN protein; recurrence

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.05.014

2016-01-22；

2016-04-20

R781.7

A

秦旭平)