耐辐射短梗霉黑色素的发酵条件优化及稳定性研究

朱 静，房世杰，王 玮，唐琦勇，张志东，张丽娟，顾美英，宋素琴

（1.新疆农业科学院微生物应用研究所，乌鲁木齐 830091；2.新疆农业科学院科研管理处，乌鲁木齐 830016）

耐辐射短梗霉黑色素的发酵条件优化及稳定性研究

朱 静1，房世杰2，王 玮1，唐琦勇1，张志东1，张丽娟1，顾美英1，宋素琴1

（1.新疆农业科学院微生物应用研究所，乌鲁木齐 830091；2.新疆农业科学院科研管理处，乌鲁木齐 830016）

【目的】利用响应面法对出芽短梗霉菌株MF1发酵水溶性黑色素工艺条件进行优化，开展稳定性研究。【方法】利用 Design－expert 7.5设计软件，以黑色素产量为指标，采用 Plackett－Burman法筛选出三个重要因素，使用 Box－Benhnken中心组合设计并进行条件优化。【结果】响应面优化及各因素交互作用分析确定最佳发酵条件为：装添量为100mL，葡萄糖为10.3g／L，酵母浸粉为2.02g／L时，黑色素最高产量达到0.53g／L。所得黑色素具有良好的水溶性，较高的酸碱、热稳定性，不易被氧化还原，金属离子对色素稳定性影响不显著。【结论】葡萄糖、酵母浸粉和装填量为影响黑色素产量的三个主要因素，为天然水溶性黑色素的中试放大、大规模生产及应用奠定了基础。

黑色素；出芽短梗霉；响应面；发酵

0 引 言

【研究意义】天然黑色素（melanin）是一种广泛存在于动植物和微生物中的非均质类多酚聚合体，是一类高分子量褐色 －黑色素的总称［1］。黑色素在紫外线和可见光波长（150～800 nm）均具有良好的光吸收作用，特别是在紫外光下具有极强的吸收能力［2］。其一般可溶于碱性溶液，不溶于酸性溶液，微溶于水，不溶于常见有机溶剂；具有较强的清除自由基、抗氧化等功能，优于SOD、VE等常规抗氧化产品［3，4］；部分黑色素具有电导性等功能，部分可溶性黑色素在体外对艾滋病病毒有显著的抑制作用，可广泛应用于农业、食品、材料和化学及医药等领域［5－9］。因此，黑色素应用潜力巨大。【前人研究进展】微生物来源的黑色素种类多样，自然界中多种微生物可产黑色素，包括细菌、放线菌和霉菌等［10］。但黑色素不是微生物生长、代谢所必须的代谢产物，所以产量一般都不 高［11］。出芽 短 梗 霉 （Aureobasidium pullulans）是一种具有酵母型和菌丝型形态的多形真菌，因生长后期易产生黑色素而一度被认为是“黑酵母”。该菌是工业生产中重要生物材料短梗霉多糖（普鲁兰多糖，Pullulan）的生产菌株［12］，其厚垣孢子积累黑色素［13］，可抵抗紫外线、高渗胁迫及重金属毒害等多种逆境［14－16］。目前对其相关菌株的耐辐射特性和机理研究发现，黑色素的产生对真菌的耐辐射作用至关重要，部分真菌黑色素甚至可以俘获离子辐射能量作为能源［17］。【本研究切入点】从新疆辐射污染土样中分离筛选出多株短梗霉菌株［13］。其中，菌株 MF1在发酵中大量产生水溶性黑色素。研究相关文献报道较少。【拟解决的关键问题】在前期单因素发酵优化的基础上［18］，利用响应面法进行进一步的优化，并对其黑色素的理化性质及稳定性进行研究，为天然黑色素在实际生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌种

实验菌株MF1由新疆农业科学院微生物应用研究所提供，分离自辐射污染环境土壤，经系统鉴定为出芽短梗霉变种（Aureobasidium pullulans var sp.），该菌株可以在60Coγ射线 20 kGry剂量照射下存活［13］。

1.1.2 培养基

MEA培养基：麦芽浸粉 30 g，大豆蛋白胨3 g，琼脂15 g，加蒸馏水配制 1 L，pH 5.6。

发酵培养基：葡萄糖10 g，K2HP045.0 g，酵母浸粉2.0 g，MgS040.4 g，（NH4）2SO40.6 g，NaCl 0.1 g，蒸馏水1 L，pH 6.5。

1.2 方 法

1.2.1 菌株接种

将保存的出芽短梗霉菌株接种于 MEA培养基斜面上，于30℃培养2～4 d。取新鲜斜面菌种1环，接种于100mL液体MEA培养基中，30℃，180 r／min，培养 48 h。取 lmL菌液接种于100mL液体发酵培养基中，30℃，180 r／min，培养 5～7 d。

1.2.2 黑色素的测定及提取

从新鲜斜面挑取一环菌苔，接种于100mL液体MEA培养基中，30℃，180 r／min摇床培养48 h，取1mL菌液接种于 100mL发酵培养基中，30℃180 r／min摇床培养96 h后，离心去菌体，上清液采用紫外分光光度计于400 nm下测定其光吸收值。

将发酵液离心取上清，2倍无水乙醇沉淀，9 000 r／min离心5 min后，弃上清液，沉淀于80℃烘干24 h后，所得产物为黑色素粗提物。再经DMSO溶解，5 000 r／min离心10 min，用酸性甲醇（pH＝2）做沉淀剂重复2次，最后的沉淀用丙酮洗涤3次，烘干备用。

1.2.3 二水平设计

使用 Design－expert 7.5设计软件，对初始发酵培养基中的主要成分及装填量、接种量等6个实际因素，5个虚拟因素进行试验分析，采用试验次数 N＝12的Plackett－Burman设计，对11因素进行考察，响应值 Y为黑色素浓度（OD值，已稀释800倍）。其中，6个实际因素两水平分别取原水平的 ±0.25倍，测定各因素对黑色素产量的影响显著性。表1

表1 Placket－Burman设计及因素水平Table 1 Plackett－Burman design and factor level

1.2.4 响应面分析

根据二水平设计结果，选出影响最大的三个因素作为考察因素，采用Box－Behnken中心组合实验设计，各取3水平，采用3因素3水平的共计14个实验点，其中12个分析点，2个为对照，进行响应曲面分析方法对发酵条件优化。

1.2.5 黑色素稳定性

称取一定量的黑色素提取物，使用去离子水配置成不同浓度的黑色素溶液。分别取5mL上述黑色素溶液，各加入不同体积的氧化剂、还原剂、金属离子等溶液，加入去离子水定容至50mL，置于不同条件下处理，于 λ＝400处测定其OD值，根据残余率（%）＝处理样 OD／对照样OD×100%，计算色素残余率。

2 结果与分析

2.1 黑色素紫外 －可见光吸收光谱测定

研究表明，水溶性黑色素在紫外 －可见光谱200～800 nm均有不同程度的吸收，其中在紫外光谱下吸收更大，225 nm具有一最大吸收峰，随之迅速下降，这一特性与目前已有报道黑色素有着明显的差别。一般而言，黑色素由于高度的共轭效应而产生广谱的光吸收特性。但不同的菌种所产黑色素有所不同，如宁华等［1］从酪氨酸基因工程菌提取的黑色素紫外扫描显示无特征峰，段晓红等［19］从嗜麦芽假单胞菌 ATl8获得的黑色素紫外扫描显示在210 nm有一特征吸收峰。目前，一般选择 400 nm波长来测定黑色素的吸收值。图1

2.2 Placket－Burman优化

选用试验次数 N＝12的试验设计，对6个实际因素和3个虚拟因素（A－I）进行考察，得到响应值 Y为黑色素浓度。通过二次项计算，得出各因素效应结果。表2，表3

葡萄糖、酵母浸粉、装填量对菌株产生黑色素的影响较大，影响率分别为 29.05%、28.78%、10.07%。其中葡萄糖，酵母浸粉，装填量对产生黑色素的影响均为正相关，即随着葡萄糖、酵母浸粉、装填量的增加，黑色素的产生量也随之增加，而虚拟因素对系统影响率均小于 10%，结果可信。因此，可选择葡萄糖、酵母浸粉、装填量三个因素为主要因素进行下一步实验。表3

图1 黑色素的紫外—可见光吸收图谱Fig．1 Melanin UV－visible absorption spectrum

表2 Placket－Burman设计及试验结果Table 2 Plackett－Burman design table and test results

表3 各因素效的影响效应Table 3 Efficiency factors of each factor

2.3 响应面表设计及模型

2.3.1 Box－Behnken实验结果

依据Placket－Burman分析结果，采用 Box－Behnken实验设计，结果表明，回归模型方差分析。由表 4中，F回归＝7.15＞ F0.0500，可知设计中不同处理间差异不显著；失拟项 P＝0.016 5＜0.05，差异显著，说明残差均由随机误差引起；R2为0.936 0，表明方程可较好的预测结果；其二次方程为：表4，表5

R＝167.50＋15.62×A＋8.87×B＋14.75× C－2.25×A×B＋14.50×A×C－9.00×B×C－22.62×A2－27.62×B2＋3.62×C2.

表4 响应面设计与结果Table 4 Response surface design and results

表5 回归模型方差分析Table 5 Regression model analysis of variance

2.3.2 响应面及等高线图解析

对表1的结果作响应面及其等高线，结果表明，各图表示A（葡萄糖）、B（酵母浸粉）、C（接种量）中任意一个变量取零水平时，其余两个变量对其发酵优化的交互影响。研究表明，各因素交互作用对响应值的影响，图中等高线均存在极值，即响应面的最高点，说明试验所选范围较合理。三个响应面的等高线总体为圆形或椭圆形，说明交互作用不是很强，但是不同因素间交互仍然有着明显的差异。葡萄糖量和装填量对黑色素产量的影响更大（图2（a）、（c）），而酵母浸粉相对较为平缓，葡萄糖与装填量两者有一定的交互作用，但等高线几乎为圆形，说明作用不是很强（图2（b））。图2

图2 葡萄糖、酵母浸粉、装填量与黑色素产量的交互作用Fig．2 Interaction of glucose，yeast extract，the filling amount and melanin production

2.4 发酵工艺条件的确定

结合回归模型分析结果可知，天然水溶性黑色素的最佳发酵工艺条件为：装添量为 100mL，葡萄糖10.3g／L，酵母浸粉2.02g／L，硫酸铵2.0g／L，NaCl 0.5g／L，接种量为 2mL，pH自然，30℃，180 r／min摇床培养96 h。通过实验验证，在此条件下黑色素的理论提取率为 0.57g／L，实际产量最高为0.53g／L。因此，响应面分析法所优化的最适宜发酵工艺条件真实可靠。

2.5 黑色素的稳定性

2.5.1 黑色素热稳定性

分别将色素溶液置于不同温度温箱中加热 2 h，冷却至室温，在波长 400 nm处测定其吸光度，计算残余率。研究表示，该黑色素具有极其高的热稳定性。图3

图3 不同温度下黑色素稳定性变化Fig．3 Effect of temperature on the stability of melanin

2.5.2 黑色素pH稳定性

使用 HCl和 NaOH分别调成不同pH的黑色素溶液，室温过夜放置，于波长 400 nm处测定吸光度，计算残余率。研究表明，黑色素具有较高的pH稳定性，在酸性情况下黑色素有所下降，可能由于多糖消解，部分黑色素游离后在酸性情况下沉淀。而碱性条件也可能多糖水解，但黑色素可良好的溶于碱性条件下，所以影响不大。图4

图4 不同pH下黑色素稳定性变化Fig．4 Effect of pH on the stability of melanin

2.5.3 氧化剂对黑色素稳定性的影响

使用NaClO和 H2O2分别调成不同浓度氧化剂的黑色素溶液，室温放置不同时间后，于波长400 nm处测定其吸光度，计算残余率。研究表明，该色素在氧化剂中具有较好的稳定性。这也与其他菌种黑色素的结论相一致：真菌黑色素可抵抗高锰酸钾盐、次氯酸盐及其他氧化物的氧化作用；说明不同菌种所产黑色素都具有抗氧化剂的功能。表6，表7

2.5.4 还原剂对黑色素稳定性的影响

使用Na2S2O3配制不同浓度的黑色素溶液，室温放置不同时间后，于波长400 nm处测定其吸光值，计算残余率。研究表明，黑色素对硫代硫酸钠具有一定的抗还原功能，但高浓度的还原剂对黑色素影响较大。表8

2.5.5 金属离子对黑色素的影响

分别使用0.05 M金属离子配制黑色素溶液，室温放置一周后，于波长400 nm处测定其吸光度，计算残余率。研究表明，该黑色素在0.05 M金属离子环境下总体具有较好的稳定性，但不同离子的影响不 同，K＋、Na＋无影响，Al3＋、Zn2＋、Mg2＋、Mn2＋具有增效作用，而 Cu2＋、Ca2＋具有降效的作用。同时在实验过程中，随着离子浓度增高，黑色素稳定性明显降低。图5

表6 不同浓度 NaClO下黑色素稳定性变化Table 6 Effect of NaClO on the stability of melanin

表7 不同浓度H2O2下黑色素稳定性变化Table 7 Effect of H2O2on the stability of melanin

表8 不同浓度Na2S2O3下黑色素稳定性变化Table 8 Effect of Na2S2O3on the stability of melanin

图5 不同金属离子下黑色素稳定性变化Fig．5 Effects of different metal ions on the stability of melanin

3 讨 论

微生物产生的黑色素可分为胞内黑色素和胞外黑色素两大类。黑色素一般不溶于水、酸及大部分有机试剂，但在某些情况下，黑色素与蛋白质或者糖类结合，会导致黑色素具有一定的水溶性［20］。研究选用的出芽短梗霉分离自辐射区污染土壤，通过对菌株的研究发现，该菌易于培养，在发酵过程中黑色素与短梗霉多糖同时产生并结合。该菌除产生大量胞内黑色素外还产生大量可溶性的黑色素，推测可能是因为与多糖紧密结合使其具有了良好的水溶性。已有研究表明，微生物合成黑色素的能力可能与其提高自身环境生存能力有关，这是因为黑化的细胞壁更加完整，可以增强其抵抗冷、热、干旱等恶劣环境的能力。此外，黑色素还可以结合自然界中一些对细胞存在潜在伤害的重金属元素，使微生物在较严重的污染环境下仍能较好生存。此外，黑色素还可以起到生理性氧化还原缓冲液的作用，因此，在黑化的微生物中许多都具有抵抗氧化伤害的能力［21］。实验选用的菌株为耐辐射菌，具有较强的耐 γ射线辐射和耐 UV能力［13］，这可能与其大量产生黑色素有关。

利用Design－expert软件的Planket－Burman设计法对黑色素产生菌的发酵条件进行筛选优化，发现葡萄糖、酵母浸粉和装填量是三个最主要的影响因素。研究中的黑色素的产生与细胞生长是半偶联发酵，其中葡萄糖和酵母浸粉不仅为细胞生长提供碳、氮源及微量元素，以利于细胞的生长，同时为黑色素的合成提供能源、碳骨架和氮元素。有相关报道指出，短梗霉黑色素发酵生成与发酵液中的氮碳比有关［22］，因此，葡萄糖和酵母浸粉的添加量对发酵黑色素起到重要的作用，而发酵装填量主要涉及发酵中的供氧。

4 结 论

研究利用发酵法制得的黑色素符合了黑色素的基本特征，不仅具有良好的水溶性，还具有较高的热、酸碱稳定性，并且对 H2O2和 NaClO有较好的耐受性及金属离子对色素稳定性影响不显著。使用 Placket－Burman设计对发酵中的6个因素进行筛选，得出葡萄糖、酵母浸粉和装填量为影响黑色素产量的三个主要因素，通过响应面优化，得到最适宜发酵条件参数为：装添量为100mL，葡萄糖10.3g／L，酵母浸粉2.02g／L，硫酸铵2.0g／L，NaCl 0.5g／L，接种量为2mL，pH自然，30℃，180 r／min摇床培养96 h，在此条件下最高产量可达0.53g／L。

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Study on the Optimization of Fermentation Conditions and Stability of Melanin from a Radiation－resistant Aureobasidium pullulans

ZHU Jing1，FANG Shi－jie2，WANG Wei1，TANG Qi－yong1，ZHANG Zhi－dong1，ZHANG Li－juan1，GU Mei－ying1，SONG Su－qin1
（1．Research Institute of Microbiology，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091，China；2．Scientific Research Management Office of Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830016，China）

【Objective】Response surface analysis was applied in current study to optimize the fermentation process of water－soluble melanin produced by Aureobasidium pulluans strain MF1，and to assess the stability of the melanin.【Method】Three factors were determined to be most influential factors on melanin yield among all tested factors via Plackett－Burman design.Box－Behnken design was subsequentially applied to adjust the parameters during the fermentation.All analysis was processed in Design－expert 7.5 software.【Result】The fermentation achieved the highest melanin yield of 0.53g／L in raw broth with 100mL broth in 500mL flask，of which the glucose concentration was 10.3g／L，and yeast extract was 2.02g／L.The melanin yielded from our process was fair in water solubility，and was of high stability in heat，acid，alkaline，oxidation or reduction circumstance.Metal ions showed insignificant effect on pigment stability.【Conclusion】The results showed that the glucose，yeast extract and the filling amount were fundamental factors influencing the melanin fermentation produced with A．pulluans strain MF1.Our study laid foundation for the pilot scale，large－scale production of water－soluble natural melanin in the future.

melanin；Aureobasidium pullulans；response surface methodology；fermentation

S182

A

1001－4330（2016）09－1692－08

10.6048／j.issn.1001－4330.2016.09.017

2016－03－03

新疆维吾尔自治区高技术研究发展计划（201511105）

朱静（1981－），河南人，女，副研究员，硕士，研究方向为特殊环境微生物学，（E－mail）122543537＠qq.com

（Cotresponding author）：张志东（1977－），男，河南人，研究员，硕士，研究方向为特殊环境微生物学，（E－mail）zhangzheedong＠sohu.com

Fund project：Supported by Xinjiang HighTechnology Research and Development Program（Grant No.201511105）