豚鼠脑缺血再灌注后听皮层内质网应激相关因子的表达及意义△

吕哲张颖王团徐鸥路虹

豚鼠脑缺血再灌注后听皮层内质网应激相关因子的表达及意义△

吕哲1张颖1王团2徐鸥1路虹1

目的 观察豚鼠脑缺血再灌注后葡萄糖结合蛋白（glucose－regulated protein，GRP78）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－12（caspase－12）在听皮层的表达，探讨内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在脑缺血再灌注后听皮层神经元凋亡中的作用。方法 选取健康豚鼠50只，随机分为5组：正常对照组、A组（缺血再灌注6 h）、B组（缺血再灌注12 h）、C组（缺血再灌注24 h）、D组（缺血再灌注72 h）。采用夹闭双侧颈总动脉的方法建立脑缺血再灌注损伤模型，分别在脑缺血再灌注后6、12、24、72 h行听性脑干反应（ABR）测试后处死各组豚鼠，应用HE染色法观察听皮层神经元病理变化，免疫组化染色及Western－blot方法检测各组GRP78、caspase－12的表达。结果 从正常对照组到B组豚鼠ABR反应阈值逐渐增加，从C组到D组又逐渐下降，但D组仍比正常对照组高（P＜0.05）。HE染色示正常对照组听皮层神经元排列整齐，胞浆丰富，胞核大而圆，染色清晰；A、B、C、D组听皮层神经元均有不同程度的数量减少，且体积萎缩，胞核固缩，碎裂，核仁消失。免疫组化染色及Western－blot示正常对照组GRP78、caspase－12蛋白仅有微量或少量表达，缺血再灌注后6 h，二者表达开始上调，至12 h GRP78表达达到高峰，12 h后逐渐降低，各组之间差异均有统计学意义（P＜0.05）。caspase－12表达24 h达到峰值，后逐渐下降，缺血再灌注6 h组与12 h组间差异无统计学意义，其余各组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 脑缺血再灌注损伤可诱发内质网应激，使GRP78、caspase－12表达增加，GRP78、caspase－12可能参与了ERS介导的听皮层神经元细胞凋亡过程。

内质网应激； 缺血再灌注损伤； 凋亡

内质网应激反应（endoplasmic reticulum stress，ERS）近年来备受国外学者的关注，尤其是其在脑缺血再灌注后听皮层神经元凋亡过程中的作用更是研究者关注的重点之一。脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未恢复，反而出现了更加严重的机能障碍，称之为缺血再灌注损伤。脑缺血再灌注可诱发内质网应激，激活内质网凋亡途径，导致神经细胞凋亡；听觉皮质接受来自大脑中动脉的血供，在缺血缺氧情况下容易发生细胞凋亡。本研究旨在通过建立豚鼠脑缺血再灌注损伤模型，检测其听皮层组织中葡萄糖结合蛋白（glucose－regulated protein，GRP78）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－12（caspase－12）的表达，探讨脑缺血再灌注对听皮层神经元细胞内质网应激反应的诱导及ERS介导的神经元凋亡过程，为临床血管病变造成听损伤的治疗提供理论依据及新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选择健康白色雄性豚鼠50只，购于河北医科大学实验动物中心，体重400～450 g，双耳ABR反应阈均在10 d B SPL以内，随机分为正常对照组、A组（缺血再灌注6 h）、B组（缺血再灌注12 h）、C组（缺血再灌注24 h）、D组（缺血再灌注72 h），每组10只。

1.2 试剂和仪器 PXS－1020型体视解剖显微镜，ICS－CHARTR－EP型ABR电位仪（北京麦德森医疗器械），免疫组化试剂盒（河北博海生物工程有限公司），兔抗鼠GRP78抗体（美国SANTA Cruz），兔抗鼠caspase－12抗体（美国SANTA Cruz），HRP标记羊抗兔IgG（碧云天生物技术公司），BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术公司）。

1.3 脑缺血再灌注动物模型的建立 A、B、C、D组动物以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，于颈部正中切口逐层分离暴露两侧颈总动脉后用微动脉夹夹闭两侧颈总动脉，计时15 min后恢复血流灌注，冲洗创口对位缝合。在夹闭双侧颈总动脉后豚鼠出现翻正反射消失、双侧瞳孔散大、对光反射消失，呼吸平稳无抽搐，清醒后反应迟钝，无偏瘫或癫痫［1］，为脑缺血再灌注动物模型建立成功。对照组动物不作任何处理。

1.4 听性脑干反应（auditory brainstem response，ABR）测试 对照组及A、B、C、D组于脑缺血再灌相应时间点行ABR检测。动物水合氯醛腹腔注射麻醉后置于隔声屏蔽室内，采用美国ICS听性脑干诱发电位仪检测，刺激声为短声，极性为交替波，速率为21.1次／秒，增益为50 k，以可引出波III的最小刺激强度定为ABR反应阈。

1.5 动物听皮层标本制备及染色观察 参照《大鼠脑立体定位图谱》［2］，确定豚鼠听皮层区域。

完成ABR检测后，每组取2只豚鼠麻醉后，开胸经心尖依次灌注生理盐水和多聚甲醛，取出整个大脑置于4%多聚甲醛中固定24 h。固定后二次取材，经脱水、透明、浸蜡、包埋等步骤制成石蜡块，确定听皮层区域，用石蜡切片机连续切片，行HE染色及免疫组化检测。各组其余8只豚鼠麻醉后迅速冰上断头取脑，找到听皮层，用刀片切取后尽量切碎，－80℃冰箱保存。

1.5.1 HE染色及听皮层神经元观察 二甲苯脱蜡2次，无水乙醇洗去二甲苯2次，依次浸入95%、80%、70%酒精水化，苏木精染色。然后1%盐酸酒精分化，1%氨水返蓝，伊红染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，直至轻柔甩干，中性树脂封片。观察听皮层神经元的大小、形态、分布以及胞浆、胞核、核仁变化。用Image Pro Plus 5.1彩色图像处理软件在40×10倍镜下计数每张切片的凋亡细胞。

1.5.2 免疫组化染色检测GRP78、caspase－12表达 石蜡切片经脱蜡、复水，采用辣根过氧化物酶染色，胞浆或胞核有棕黄色颗粒者为阳性细胞。全自动照相机显微镜下拍照，Image Pro Plus 5.1图像处理软件在40×10倍镜下观察并计数阳性细胞，每张切片采集5个具有代表性的高倍视野。

1.5.3 Western－blot检测GRP78、caspase－12蛋白表达 听皮层组织加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂进行低温匀浆，蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白样品含量，电泳分离蛋白，转膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗（兔抗鼠GRP78、caspase－12多克隆抗体）、二抗（HRP标记羊抗兔IgG）孵育，洗膜，增强化学发光法显色，X光胶片曝光，进行条带扫描，计算目的样本蛋白光密度与β－actin基因条带光密度比值，分析GRP78、caspase－12蛋白表达。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组ABR反应阈 正常对照组及A、B、C、D组动物双耳ABR反应阈见表1，可见从正常对照组到B组双耳ABR反应阈值逐渐增加，从C组到D组逐渐下降，但D组ABR反应阈仍高于正常对照组（P＜0.05）。

2.2 各组听皮层HE染色结果 正常对照组豚鼠听皮层神经元排列整齐，细胞体积较大，胞浆丰富呈红色，胞核大而圆，核膜清楚，核仁明显，染色清晰。A、B、C、D组（脑缺血再灌注后各时间点）听皮层神经元数量减少，分布不均，有不同程度的体积萎缩，胞浆、胞核窥视不清，核膜、核仁分界不明，胞核固缩，碎裂，核仁消失（图1）。对各组凋亡细胞数进行统计分析显示，除A组与B组比较差异无统计学意义外（P＝0.839），其余各组间差异均有统计学意义（表1）。

2.3 各组免疫组化结果 GRP78抗原阳性细胞为胞浆有棕黄色，正常对照组GRP78阳性细胞少量表达，缺血再灌注6 h后（A组）阳性细胞表达即迅速增加，至12 h（B组）达到高峰，以后表达逐渐减少，各组间差异均有统计学意义（表1，图2）。caspase－12抗原阳性细胞呈棕黄色，胞浆胞核均有表达，但以胞浆表达为主，正常对照组仅有微量表达，缺血再灌注6 h（A组）阳性细胞表达有少量增加，之后表达逐渐增加，至24 h（C组）达高峰，然后明显下降。除正常对照组与缺血再灌注72 h（D组）差异无统计学意义外（P＝0.086），其余各组间差异均有统计学意义（表1，图3）。

2.4 各组听皮层GRP78、caspase－12蛋白Western－blot检测结果 正常对照组GRP78、caspase－12蛋白仅有微量表达，缺血再灌注6 h（A组）二者表达开始上调，至12 h（B组）GRP78表达达到高峰，以后逐渐减少，各组间差异均有统计学意义。caspase－12表达在缺血再灌注24 h（C组）时达到峰值，后逐渐下降，A组与B组间差异无统计学意义（P＝0.117），其余各组间差异均有统计学意义（表1，图4）。

表1 各组ABR反应阈、凋亡细胞数及听皮层GRP78、caspase－12表达（±s）

表1 各组ABR反应阈、凋亡细胞数及听皮层GRP78、caspase－12表达（±s）

－actin正常对照组9.91±3.16 2.4±1.12 13.41±1.11 4.93±0.66 0.1组别ABR反应阈（dB SPL）凋亡细胞数（个）GRP78免疫组化表达caspase－12免疫组化表达GRP78／β－actin caspase－12／β 49±0.037 0.252±0.025 A组29.81±2.94 13.8±2.43 35.59±2.71 12.01±2.47 0.223±0.030 0.301±0.018 B组35.22±1.54 23.7±2.15 75.05±5.61 54.47±5.70 1.118±0.027 0.327±0.028 C组29.99±2.13 14.5±3.12 46.17±5.50 85.61±2.46 0.259±0.030 1.122±0.043 D组20.20±2.07 8.4±2.37 40.76±3.74 7.74±2.36 0.403±0.036 0.428±0.041 F 4 940.348 88.937 321.766 1 005.222 1 194.191 1 000.992 P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

3 讨论

内质网是细胞内蛋白质合成、翻译后修饰、折叠、运输的主要场所，在缺血缺氧、自由基损伤、毒性氨基酸等各种有害因素刺激下，内质网受到扰动，蛋白质的折叠将会受到影响，未折叠或错误折叠的蛋白大量增多并滞留于内质网腔中，进一步引起细胞功能障碍，称为内质网应激反应（ERS）［3，4］。同时，ERS也将启动细胞自我保护机制，即通过激活分子伴侣蛋白的基因转录，促使分子伴侣蛋白（如GRP78）表达增加，抑制细胞蛋白质的合成，同时加强未折叠或错误折叠蛋白的折叠或降解，以减轻内质网应激时的负担，从而抵抗应激，对细胞起到一定程度的保护作用［5，6］。然而，当内质网应激反应程度过强、持续时间过久时，则超出了内质网的保护能力范围，此时，分子伴侣（GRP78）表达不仅不再增加，反而减少，并通过激活caspase－12前体，进一步激活caspase－9、caspase－3等，最终导致细胞凋亡。

在缺血缺氧情况下，大脑皮质、海马区等缺血缺氧敏感区最易发生细胞凋亡。听觉皮质接受大脑中动脉的血供，当其受到阻塞压迫等造成血流灌注减少时，听皮质遭受缺血损伤，再灌注后又会造成再灌注损伤，听皮层神经元内质网会发生一系列的反应，如钙超载，大量活性氧自由基的产生，从而诱发ERS，使神经元细胞凋亡［7，8］。本实验在课题组原有方法的基础上［1］稍加改进，采用夹闭动物双侧颈总动脉从而造成不全脑缺血，也出现了瞳孔散大、对光反射消失，无抽搐，术后清醒后反应迟钝，没有出现偏瘫或癫痫，说明本实验的脑缺血再灌注模型造模成功。此方法创伤小，动物死亡率低，与临床实际情况更加接近，实验中无动物死亡。

图1 各组动物听皮层HE染色结果（HE×400）

图3 各组动物听皮层caspase－12免疫组化结果（免疫组化×400）

图4 各组动物听皮层GRP78、caspase－12蛋白Western－blot结果

GRP78是内质网中最主要的分子伴侣蛋白，被认为是ERS的标志物，能够协助错误蛋白折叠、维持内质网与细胞浆间的钙离子平衡，从而维持细胞内环境的稳定［9］。正常状态下，GRP78与3个内质网应激感受蛋白结合，包括肌醇需求激酶1（inositol requiring enzyme 1，IRE－1）、双链RNA依赖的蛋白激酶样ER激酶（phosphorylated extracellularsignal regulated kinase，PERK）、活化转录因子6（activating transcription factor 6，ATF6），处于无活性状态。当内质网处于应激状态时，GRP78与3个跨膜应激感受蛋白解离，并与错误折叠蛋白或未折叠蛋白结合，同时解离后的感受蛋白通过各自的信号传导途径启动未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），减少未折叠或错误折叠蛋白在内质网内累积，促进其降解［10］；因此，GRP78表达量显著增高，在一定程度上反映了ERS的启动。本实验结果显示，随着脑缺血再灌注时间的延长，听皮层GRP78蛋白表达逐渐增多，在再灌注后12小时最多，其后表达逐渐下降，提示脑缺血再灌注后诱发了ERS，以拮抗细胞凋亡、保护细胞，但当应激时间过长时（＞12 h），内质网功能结构受到破坏，出现功能障碍，超出了内质网的自我保护能力，GRP78不但不继续升高，反而下降。提示缺血再灌注12 h内对细胞内质网应激是比较合适的，超过此时间段则超出了细胞的自我调节能力，内质网应激过度，细胞凋亡及坏死将明显增加。

caspase－12也是ERS介导细胞凋亡的一个主要因素，仅在ERS时被特异性激活，非ERS相关刺激诱导的细胞凋亡中不被激活。它以酶原的形式存在于内质网的胞浆面，当内质网过度应激时被活化，激活后移位到胞质继而激活caspase－9、caspase－3引起细胞凋亡。文献报道，caspase－12缺陷的小鼠较有caspase－12表达的小鼠肾小管细胞对内质网应激更有抵抗力，而对非内质网应激途径介导的细胞凋亡，二者敏感性相似，表明caspase－12与内质网应激介导细胞凋亡的机制有关，而与非内质网应激介导的细胞凋亡（死亡受体途径和线粒体途径）无关，即caspase－12特异性的参与了内质网相关凋亡途径，因此caspase－12被认为是内质网应激介导凋亡的重要标志物［11，12］。本实验结果表明，caspase－12在脑缺血再灌注6 h后听皮层开始表达，并随着再灌注时间的延长，表达量逐渐增多，在24 h时表达最多。提示再灌注12 h后，超出了内质网的保护能力范围，此时GRP78表达下降，caspase－12前体被激活，并进一步激活凋亡相关级联反应，导致听皮层神经元凋亡。

研究显示，噪声、缺血、缺氧、耳毒性药物等都可导致感音神经性聋［13］。内质网应激介导的凋亡途径是脑缺血再灌注损伤的重要机制，因而也是脑缺血损伤听皮层引发听力下降的重要机制。本研究结果表明，脑缺血再灌注损伤可诱发内质网应激，使GRP78、caspase－12表达增加，GRP78、caspase－12参与了ERS介导的听皮层神经元细胞凋亡过程。抑制ERS，阻止其诱导的凋亡途径可能为治疗突发性聋，尤其是伴脑血管基础疾病的突发性聋提供新的治疗思路［1，14］，如：消除诱因，促进ERS特异性保护蛋白的表达；终止内质网相关凋亡途径的下传等。

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5 Ni M，Zhang Y，Lee AS.Beyond the endoplasmic reticulum：atypical GRP78 in cell viability，signalling and therapeutic targeting［J］.Biochem J，2011，434：181.

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9 Pfaffenbach KT，Lee AS.The critical role of GRP78 in physiologic and pathologic stress［J］.Curr Opin Cell Biol，2011，23：150.

10 Promlek T，Ishiwata－Kimata Y，Shido M，et al.Membrane aberrancy and unfolded proteins activate the endoplasmic reticulum stress sensor Ire1 in different ways［J］.Mol Biol Cell，2011，22：3520.

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13 丁中家，唐晓旭，陈鑫，等.谷氨酸损伤体外培养大鼠螺旋神经元中凋亡诱导因子的表达与分布［J］.听力学及言语疾病杂志，2014，22：620.

14 路虹，王团，徐鸥，等.内质网应激与听力损伤的相关研究［J］.中国耳鼻咽喉头颈外科，2014，21：220.

（2015－10－12收稿）

（本文编辑 李翠娥）

Expression of the ERS－associated Factors on Auditory Cortex after Brain lschemia Reperfusion lnjury in Guinea Pig

Lv Zhe*，Zhang Ying，Wang Tuan，Xu Ou，Lu Hong
（*Department of Otolaryngology，The Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，050000，China）

Objective To investigate the expression of GRP78 and caspase－12 on the auditory cortex and to study the effects of endoplasmic reticulum stress in the auditory cortex neuron apoptosis after the brain ischemia reperfusion injury in guinea pig.Methods Fifty healthy male guinea pigs were selected and randomly divided into 5 groups which were hormal group group A（reperfusion for 6 hours），group B（reperfusion for 12 hours），group C（reperfusion for 24 hours），group D（reperfusion for 72 hours）.The cerebral ischemia reperfusion injury model was produced by the occlusion of bilateral common carotid arteries.The guinea pigs were sacrificed at reperfusion of 6，12，24，and 72 hours respectively after they received ABR tests.The pathological changes were observed by HE and the levels of GRP78 and caspase－12 protein were detected by immunohistochemistry and Western blot.Results The hearing thresholds increased gradually from the normal group to group B，and decreased gradually from group Cto group D，but the thresholds of group D were still higher than that of the normal group.HE staining showed that the neurons in the normal control group were arranged in order，the cytoplasm was abundant，large and round.The cells were stained clearly.After reperfusion，the number of neurons in each time point was decreased，the nucleus presented atrophic，fragmented，the disappeared.The expression of GRP78 and caspase－12 protein in normal control group was only a trace or a small amount by immunohistochemistry and Western blot.The expression of GRP78 and caspase－12 began to inerease.The expression of GRP78 reached the peak at reperfusion of 12 hours and decreased gradually.There were significant statistic differences between each group comparison.The expression of caspase－12 reached the peak at reperfusion of 24 hours，then decreased gradually.There was no statistic difference between group A and group B.There were significant statistic differences anong other groups.Conclusion Endoplasmic reticulum stress（ERS）may be induced by brain ischemia reperfusion injury，and can increase the expression of GRP78 and caspase－12.GRP78 and caspase－12 participate in the process of neuron apoptosis on auditory cortex caused by ERS.

Endoplasmic reticulum stress； Ischemia reperfusion injury； Apoptosis

10.3969／j.issn.1006－7299.2016.04.013

时间：2016－6－29 16：11

R339.16

A

1006－7299（2016）04－0377－05

△ 河北省卫计委医学科学研究基金（ZL20140118）资助

1 河北医科大学第二医院耳鼻咽喉科（石家庄 050000）； 2 河北省邯郸市第三医院耳鼻喉科

吕哲，女，河北人，医学硕士，副主任医师，主要研究方向为耳科疾病的基础和临床研究。

路虹（Email：wx_900804＠163.com）

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20160629.1611.028.html