正交设计法探讨橘皮多糖的提取

张星和+张珊珊

【摘要】用正交实验法讨论从橘皮中提取多糖的最佳实验条件，探讨了不同提取时间、酶解温度、pH和料液比（酶用量）等条件对提取得率的影响，结果表明，在酶解时间75min，料液比1：60g/mL，酶解温度45℃，pH为5.0时多糖的提取率最高。

【关键词】酶法;橘皮;正交实验设计

多糖又叫多聚糖（polysaceharides，Ps），是由多个相同或不相同的单糖以糖苷键相连而成的极性复杂大分子，分子量为数万，数十万到数百万，甚至有的达上千万。多糖有促进免疫调节、抗心肌缺血、抑制肿瘤、抗癌及降低血糖等生物活性。目前多糖的提取有热水提醇沉法、水浸提法、酶解提取法、微波辅助提取法和超声波辅助提取法等。结合试验室条件，试验采用纤维素酶法对橘皮中的多糖进行提取，并以多糖得率为指标通过正交设计优选最佳提取工艺。

一、材料与方法

1、材料与设备

橘子购于保山集市，购回后将橘皮取下，洗净，切小，将其置于阳光充足的地方晒干;纤维素酶（BR，30U/mg，上海博奥生物科技有限公司）;其他试剂均为分析纯。

HH-S26s数显恒温水浴锅;GUO HUA 800低数离心机;JH-14-07 A-14-07-161型可见分光光度计;DFT-200型手提式高速万能粉碎机;DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱等。

2、多糖含量的测定

目前，多糖的测定方法主要有蒽酮硫酸法和苯酚硫酸法，本实验采用第二种方法，以干燥至恒重的葡萄糖为标准品。

3、橘皮多糖的制备

准确称取过60目筛的橘皮若干于圆底烧瓶中，加少量蒸馏水浸泡24h，加入一定量的酶溶液并调pH值，放入恒温水浴锅中酶解一段时间后取出，离心得上清液。再将剩余沉淀重复酶解两次，合并上清液。放入90℃的水浴锅中灭活10min，冷却。用80%乙醇沉淀，离心得粗多糖，待显色后于490nm出测定吸光度A。

4、粗多糖提取率计算

多糖得率（%）=（多糖含量/原料重量）*100%

5、酶法提取的正交实验

影响多糖提取率的因素很多，如酶的添加量，反应时间，反应温度及其pH值。针对这些因素，采用四因素三水平的正交实验确定橘皮多糖酶解法提取的最佳条件，具体参数见表1。

表1：因素水平表

二、结果与讨论

1、葡萄糖标准曲线

由实验得出的结果以葡萄糖浓度为横坐标（x），吸光度（y）为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线如图1所示。

图1：葡萄糖标准曲线

标准曲线回归方程为y=0.5021x+0.0163，R2=0.994，线性关系良好。

2、酶法提取条件的优化

取样品每份0.500g，按照L9（34）分9组实验，得到的数据如表2所示。

表2：正交表和实验分析结果

由直观分析可知，RC>RA>RB>RD，四个影响多糖提取率的因素主次顺序，分别是C>A>B>D，即酶的添加量>酶解温度>pH>酶解时间，最佳参数为A2B2C3D2，即以料液比1：60，在pH为5.0的缓冲溶液中，回流提取75min，提取温度定为45℃，反复提取三次，多糖提取率最高。按照最佳反应条件进行三次验证实验，结果橘皮多糖的提取率为27.10%，较最高5号样26.94%略高。

三、结论

本文采用纤维素酶解新方法提取橘皮多糖，该工艺通过酶水解破坏植物细胞壁的作用，可以使细胞内的多糖物质充分溶出，从而显著提高了橘皮多糖提取率。

为进一步优化酶解法提取多糖实验条件，本实验用L9（34）正交表考察了酶添加量（液料比）、酶解温度酶解时间以及pH4个因素对提取率的影响。在最佳条件下，纤维素酶法提取橘皮多糖的提取率为27.10%。

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