早胜牛GH基因多态性与其生长发育性状的相关性分析

张艳丽，容维中，徐建峰，任茂源，郭彬彬

(1.平凉市农产品质量安全检测检验中心,甘肃 平凉 74400;2.甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃 平凉 744000;3.华池县草畜产业示范园区管理办公室，甘肃 华池 745600)



早胜牛GH基因多态性与其生长发育性状的相关性分析

张艳丽1，容维中2*，徐建峰2，任茂源3，郭彬彬3

(1.平凉市农产品质量安全检测检验中心,甘肃 平凉 74400;2.甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃 平凉 744000;3.华池县草畜产业示范园区管理办公室，甘肃 华池 745600)

[目的]为研究GH基因多态性对早胜牛生长发育性状的影响，确定可用于肉牛新品种选育的优势基因型。[方法]采用PCR-SSCP方法和DNA测序技术检测了GH基因第2外显子及第5外显子的遗传多态性，应用最小二乘线性模型分析了不同基因型与不同生长阶段体重、体尺及肉用指数的相关性。[结果]GH基因第2外显子存在2处SNPs，产生了2个等位基因和3种基因型，多态信息含量为0.21，属于低度多态；第5外显子存在3处SNPs，产生2个等位基因了和2种基因型，多态信息含量为0.32，属于中度多态。相关性分析表明，第2外显子，初生重和6月龄重，BB型与AB显著高于AA型(\%P\%<0.05)；周岁重，BB型显著高于AA型与AB型(\%P\%<0.05)；第5外显子，初生重、6月龄重、周岁重及肉用指数，CD型都显著高于CC型(\%P\%<0.05)。[结论]GH基因第5外显子多态性更为丰富，选择潜力较大，可以作为早胜牛肉用方向选育的有效分子标记。

早胜牛；GH基因；PCR-SSCP；生长发育性状；选育

畜禽遗传资源对促进畜牧业可持续发展和丰富生物多样性具有重要的科学意义与应用价值。早胜牛是甘肃省陇东地区经过30多年的实践选育而成的优良地方类群，具有较高的秦川牛血统，在生产性能和体型外貌上更加接近秦川牛，是甘肃省黄牛改良的当家品种，于2009年列入甘肃省25个畜禽遗传资源保护品种之一[1]。

随着分子生物学的快速发展，应用分子标记技术研究影响畜禽经济性状表达的功能基因及其多态性，并以此挖掘和利用地方品种的优良特性，已成为动物遗传育种研究的热点之一。生长激素(GH)是由脑垂体分泌的一种具有广泛生理功能的多肽类激素，对脊椎动物的骨骼生长及分化，糖类、蛋白质及脂肪代谢具有重要的调节作用[2-3]，研究表明[4-6]，GH基因多态性对畜禽生长发育性状及肉用性状具有显著影响。

本研究以挖掘早胜牛品质内涵和丰富遗传多样性为宗旨，采用PCR—SSCP检测技术和DNA测序技术对早胜牛GH基因第2外显子及第5外显子多态性进行研究，并运用最小二乘线性模型对不同基因型与生长发育性状的相关性进行分析，以期确定可用于早期肉用性状选育的优势基因型，并结合体型外貌选留优秀个体组建核心群，加快甘肃肉牛新品种选育进程，促进优良种质资源的保护和集成创新。

1 材料与方法

1.1 试验动物及血样采集

186头体质健康、发育良好的早胜牛(公牛63头、母牛123头)均来自庆阳市宁县兴旺牧业有限责任公司，采用静脉采血法每头牛采集血样6 mL，加入柠檬酸葡萄糖抗凝后低温条件下带回实验室，于-20 ℃保存待用。

1.2 DNA提取及检测

采用Omegabiotek公司生产的D3471型血液DNA提取试剂盒对基因组DNA进行提取，经浓度为10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，检测合格的DNA样品，用于PCR反应。

1.3 引物设计及PCR扩增

采用Prime 5.0 软件在GH基因第2外显子及第5外显子区域设计2对特异性引物，由北京三博远志生物技术有限责任公司进行合成。其中，第2外显子引物序列(命名为GH-1)：上游5′-TTGGGCTTTAGGGCTTCCGAA-3′，下游5′- TGAACTCCTCAGTTTCCTCCC-3′；第5外显子引物序列(命名为GH-2)：上游5′-TCTCCAAGCCTGTAG-3′，下游5′-GCTGGCAACTAGAAG-3′。

参考《分子克隆实验指南》(第三版)[7]，优化确定PCR反应体系及反应条件(表1、表2)，PCR 产物经浓度为10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

表1 PCR反应体系

表2 PCR反应程序

1.4 SSCP检测及基因测序

取2 μL PCR产物与6 μL变性缓冲液(φ=98 %的甲酰胺、10 mmol/L EDTA、0.25 g/L的溴酚蓝、0.25 g/L的二甲苯青)混匀，98 ℃变性10 min，冰浴5 min，然后上样于φ=12 %和交联度=29:1的非变性聚丙烯酰胺凝胶)，220 v 电压4 ℃恒温恒压电泳16 h。根据银染结果进行判型，将不同基因型送至北京三博远志生物技术有限公司进行纯化和测序。

1.5 测定指标及数据处理

采用BioEdit软件分析碱基突变情况，采用PopGen 32、PIC CALC V0.6软件计算等位基因频率、基因型频率、群体纯合度(Ho)、杂合度(He)和多态性信息含量(PIC)。

根据不同生长阶段，测定试验牛初生、1月龄、6月龄、周岁体重及周岁体高、体长、胸围、肉用指数等指标，建立最小二乘线性模型，采用SPSS 13.0 软件对GH基因不同基因型与生长发育性状进行关联分析。

最小二乘线性模型：

\%yijkmn=\%μ+\%Farmi+Breedj+Agek+Sexm+Markern+eijkmn\%

其中：yijkm 为个体表型记录；μ为群体均值；Farmi为场别效应；Breedj为品种效应；Agek 为年龄效应；Sexm为性别效应；Markern为标记基因型效应；eijkm为随机误差。

2 结果

2.1 PCR-SSCP检测

GH基因第2外显子及第5外显子扩增结果显示，PCR扩增产物条带清晰，无非特异性片段，且片段长度与目的条带大小基本一致(图1、图2)，可以进行SSCP检测。

图1 GH第2外显子PCR扩增

经SSCP检测和DNA测序后发现，与Genebank公布的GH基因核苷酸序列相比(登录号：M57764)，第2外显子及第5外显子均存在多态性。其中：在第2外显子发现了2处SNPs，产生了2个等位基因(A、B)和3种基因型(AA、BB、AB)；第5外显子发现了3处SNPs，产生2个等位基因了(C、D)和2种基因型(CC、CD)。碱基突变情况见图3、图4，确定的基因型见图5、图6。

2.2 分子遗传特性分析

从表3可以看出，GH基因第2外显子，早胜牛群体中等位基因A和基因型AA的基因频率和基因型频率最高，分别为优势等位基因和优势等位基因型。群体纯合度较高，多态信息含量为0.21，属于低度多态。

图3 GH基因第2外显子不同基因型测序

图4 GH基因第5外显子不同基因型测序

图5 GH基因第2外显子SSCP检测

图6 GH基因第5外显子SSCP检测

表3 GH基因第2外显子遗传多态分析

由表4可见，GH基因第5外显子，早胜牛群体中优势等位基因和优势等位基因型分别为C和CD，多态信息含量为0.32，属于中度多态。

表4 GH基因第5外显子遗传多态分析

2.3 不同基因型与生长发育性状的相关性

从表5可以看出，GH基因第2外显子，不同基因型与不同生长阶段体重、体尺及肉用指数呈相关性。其中：1月龄重、周岁体高、周岁体长、肉用指数，3个基因型间差异不显著(\%P\%>0.05)，但从平均数来看，以BB型最高；初生重和6月龄重，BB型与AB型间无显著性差异(\%P\%>0.05)，但都显著高于AA型(\%P\%<0.05)；周岁重，BB型显著高于AA型与AB型(\%P\%<0.05)，且后者间差异不显著(\%P\%>0.05)。

表5 GH基因第2外显子不同基因型与生长发育性状关联分析

由表6可见，GH基因第5外显子，初生重、6月龄重、周岁重、肉用指数，CD型都显著高于CC型(\%P\%<0.05)；1月龄重、周岁体高、周岁体长、周岁胸围，两者间无显著性差异(\%P\%>0.05)，但以CD型较高。

表6 GH基因第5外显子不同基因型与生长发育性状关联分析

3 分析与讨论

畜禽遗传资源是保护生物多样性和培育新品种的重要生物资源。根据农业部2004～2008年全国畜禽遗传资源调查结果，我国现有牛种120个，其中地方品种94个，有38个品种的种群数量开始下降，10个品种处于濒危状态和濒临灭绝，保种形势不容乐观。早胜牛作为甘肃省特有的地方类群，通过多年选育提高，形成了适应陇东黄土高原自然环境的典型地域性，继承了秦川牛的外貌特征和脂肪沉积好的优良特性，具有培育现代肉牛的基础和潜力。因此，在基因组水平上开展早胜牛的肉用性能研究，充分挖掘其品质内涵，对地方牛种的遗传改良和种质资源创新是非常必要的。

本研究采用生子生物学技术检测了早胜牛GH基因不同位点的多态性，发现第2外显子存在2处SNPs和3种基因型，第5外显子存在3处SNPs和2种基因型，这与耿荣庆[8]、李永红[9]、高雪[10]等在其他牛种中的检测结果类似，此外，也有GH基因在其它位点存在多态性的报道[11～12]，上述研究都表明GH基因具有丰富的多态性，可以作为研究畜禽遗传多样性的候选基因。

杂合度 (He)、多态信息含量(PIC) 的大小可以用来反映群体遗传变异水平的高低，其数值越大，表明群体遗传多样性越丰富，选择潜力更大。本研究表明， GH基因第2外显子，早胜牛群体杂合度和多态信息含量分别为0.18和0.21，属于低度多态；第5外显子，群体杂合度和多态信息含量分别为0.13和0.32，属于中度多态。这表明第5外显子，早胜牛群体遗传变异程度更高，多态性更为丰富，更适合作为经济性状与基因型间连锁分析的候选标记。

关于GH基因多态性与生长发育性状的相关性报道较多，高雪等研究发现[5]，GH基因5′端，BB基因型对南阳牛6～18月龄的体长及体高呈显著的正效应。胡怡菲等[13]发现GH基因第5外显子存在2处SNPs和3种基因型，且不同基因型个体在秦川牛体高、胸围、体斜长和尻长上差异显著(\%P\%<0.05)。谷朝勇报道[14]，鲁西黄牛GH基因3′末端存在多态位点，且产生了3种基因型，AB基因型个体的体重、体高、体长、胸围和肉用指数显著高于AA型和BB型(\%P\%<0.05)。本研究再次证实了上述观点，相关性分析结果表明，GH基因第2外显子和第5外显子均存在多态性，且不同基因型与不同生长阶段体重、体尺及肉用指数具有相关性(\%P\%<0.05)，从早期选种的角度考虑，6月龄断奶重和肉用指数，以BB型和CD型最高，在生产实践中具有一定的参考价值。因此，在早胜牛肉用方向选育过程中，建议进一步加大人工选择强度，结合体型外貌线性评分，坚决选留含有BB型和CD型的优秀个体，淘汰其它基因型个体，通过导入外血、横交固定、闭锁繁育等手段，以稳定遗传其优势基因和优良特性，提高群体同质性和生产水平，加快培育具有甘肃地方特色的肉牛新品种，促进当地肉牛产业提质增效。

[1] 徐建峰,容维中,苟想珍,等.早胜牛种质资源现状调查与分析[J].中国牛业科学,2015,41(6):69-72.

[2] Malveiro E,Pereira M,Marques P X,et al.Polymorphisms at the five exons of the growth hormone gene in the Algarvia goat:possible association with milk traits[J].Small Ruminant Research,2001,41(2):163-170.

[3] Marques P X,Pereira M,Marques M R,et al.Association of milk traits with SSCP polymorphisms at the growth hormone gene in the Serrana goat[J].Small Ruminant Research,2003(5):177-185.

[4] 王靖,刘颖,董文华,等.长白猪和大白猪生长激素基因多态性及其对部分经济性状的影响[J].中国畜牧杂志,2014,50(11): 1-4.

[5] 高雪,徐秀容,任红艳,等.不同基因型对南阳牛生长发育性状的影响[J].遗传, 2006,28(8):927-932.

[6] 张恩宇,罗玉柱,李少斌,等.甘肃高山细毛羊及其杂种羊GH基因第3内含子多态性与生长性状的相关性[J].华北农学报,2015,30(5):71-76.

[7] J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔.分子克隆实验指南(第三版)(上册)[M].黄培堂译,3版,北京:科学出版社,2002:611-618.

[8] 耿荣庆,王兰萍,常洪,等.牛生长激素基因外显子5序列变异及其分子进化特征[J].西北农业学报,2009,18(2):6-9.

[9] 李永红,常洪, 耿荣庆, 等.雷琼牛GH基因第五外显子遗传多样性及其分化[J].生态学报,2007,27(12):5325-5329.

[10] 高雪,徐秀容,许尚忠,等.中国地方黄牛GH基因遗传多态性研究[J].畜牧兽医学报,2005,36(10)：991-995.

[11] 张春香,罗海玲,陈喻,等.南江黄羊GH基因外显子3多态性及其对生长性状的影响[J].草食家畜,2007,(3):13-16.

[12] 郝灵慧.草原红牛GH和GHR基因遗传多态性研究及其与胴体性状的相关分析[D].沈阳:吉林大学,2008:45-73.

[13] 胡怡菲,昝林森,王洪宝,等.秦川牛GH基因第5外显子的多态性及其与体尺性状的关联性[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2010,38(6): 46-55.

[14] 谷朝勇. 鲁西黄牛GH基因3′末端序列多态性及其与生产性状的关联分析[J].中国畜牧兽医,2010,37(10):144-147.

Association Analysis Between Polymorphism of GH Gene and Growth and Development Traits in Zaosheng cattle

ZHANG Yan-li1,RONG Wei-zhong2*,XU Jian-feng2,REN Mao-yuan3,GUO bin-bin3

(1.ExamingandInspectionCenterforAgriculturalProductsSafetyandQualityinPingLiangCity,PingLiang,Gansu, 744000;2.AnimalHusbandryandVeterinaryResearchInstituteinGansuProvince,PingLiang,Gansu, 744000;3.ManagementofficewithForagelivestockindustrydemonstrationzoneinHuachicounty,Huachi,Gansu, 745600 )

[Objective] In order to study the polymorphism of GH gene and its influence with growth and development traits of Zaosheng cattle. [Method] PCR-SSCP and DNA sequencing technologies were conducted to detect heredity polymorphism of GH gene in exon 2 and exon 5 with Zaosheng cattle, and analyzed the correlation of different genotypes with growth and development traits by Least squares linear model. [Result] There were two base mutations of exon 2 which lead to two alleles and three genotypes with achieving low polymorphism, and three base mutations of exon 5 which lead to two alleles and two genotypes with achieving intermediate plymorphism. Birth weight and body weight of six months old with BB genotype and AB genotype were significantly higher than that of AA genotype(\%P\%<0.05), and yearling weight with BB genotype was significantly higher than that of AA genotype and AB genotype(\%P\%<0.05)in exon 2, and Birth weight, body weight of six months old, yearling weight and Beef production index with CD genotype was significantly higher than that of CC genotype(\%P\%<0.05)in exon 5.[Conclusion] Polymorphism of GH gene within exon 5 was more abundant than that of exon 2, and it could be considered as maker to beef performance breeding with Zaosheng cattle.

Zaosheng cattle; GH gene; RCP-SSCP; growth and development traits; Breeding

2016-03-20

2016-03-25

甘肃省技术研究与开发专项计划(项目编号：1207TCYL016)。

张艳丽(1983-)，女，汉，甘肃静宁人，农艺师，研究方向为生物技术。

*通讯作者：容维中(1965-)，男，汉，甘肃平凉人，副研究员，研究方向为动物营养及牛羊繁殖技术。

S823

A

1001-9111(2016)04-0013-05