视明宝颗粒对形觉剥夺性弱视猫视皮层谷氨酸受体（NMDAR1）表达的影响

王高峰，陈美荣，徐琨，王静波

视明宝颗粒对形觉剥夺性弱视猫视皮层谷氨酸受体（NMDAR1）表达的影响

王高峰1，陈美荣1，徐琨2，王静波1

目的观察视明宝颗粒对形觉剥夺性弱视猫视皮质17区、21a区N-甲基-D-天冬氨酸受体1（NMDAR1）mRNA表达的影响。方法家养幼猫（4～6周龄）30只，随机分为正常组、模型组、生理盐水对照组以及视明宝低、中、高剂量组，每组5只。除正常组外其余各组均左侧眼睑缝合制作形觉剥夺弱视模型，应用视觉诱发电位（P-VEP）验证造模是否成功。采用实时定量PCR（real-time PCR）技术，检测各组幼猫双侧视皮质17区和21a区NMDAR1 mRNA的相对表达量。结果1.弱视模型幼猫左眼P-VEP与同期正常幼猫左眼P-VEP比较，P波潜伏期延长，波幅降低（P＜0.001）。2.模型组双侧17区、21a区的NMDAR1 mRNA表达均较正常组明显降低（P＜0.05），生理盐水对照组、视明宝低剂量组各脑区指标与模型组接近（P＞0.05）；中剂量组左侧21a区的表达与正常组接近（P＞0.05），其他检测部位数值与模型组、生理盐水对照组及视明宝低剂量组相当（P＞0.05）；高剂量组双侧21a区NMDAR1 mRNA表达高于其他干预组并与正常组接近（P＞0.05），左侧17区数值与各干预组大致相同（P＞0.05），低于正常组（P＜0.05），右侧17区数值高于正常组（P＜0.05）。3.双侧自身比较，在17区，视明宝高剂量组的右侧NMDAR1 mRNA表达明显高于左侧（P=0.043），其他各组双侧差异不明显（P＞0.05）；21a区，正常组、模型组、生理盐水对照组、视明宝低剂量组，右侧高于左侧（P＜0.05），高剂量组右侧低于左侧（P＜0.05）。结论视明宝颗粒可以提高形觉剥夺性弱视猫视皮质NMDAR1的表达，高剂量组作用最明显。

形觉剥夺性弱视；视觉可塑性；中药；N-甲基-D-天冬氨酸受体1（NMDAR1）

弱视是一种严重影响儿童视觉功能发育的常见眼病，治疗主要是遮盖、配镜、弱视训练及口服药物等，治疗周期长，患者依从性差，易反复，视明宝颗粒是我院已故知名眼科专家衣原良教授四十多年治疗弱视的经验方，具有补肝脾，益气血的作用，临床治疗效果显著。前期我们已对视明宝颗粒的制剂、工艺、药效等进行了研究，并观察了其对肾虚及脾气虚中医证型动物模型的有益作用。现代医学关于弱视的研究表明〔1〕，弱视的发病与初级视皮层17区及纹外皮层21a区有关，本课题通过观察视明宝颗粒对行觉剥夺性弱视猫视皮质17区、21a区N-甲基-D-天冬氨酸受体1（N-methyl-D-aspartic acid receptor 1, NMDAR1）作用的影响，进一步探讨中药治疗弱视的作用机制，为临床治疗弱视提供理论上的依据。

1 材料与方法

1.1实验材料

家养幼猫（4～6周龄），体质量约350 g，共30只，雌雄不分，活泼健康，常规检查双眼，排除其他眼部疾病。饲养于山东中医药大学附属医院实验中心，温度：18～25℃，湿度控制良好，通风良好，符合医学实验动物环境要求。

视明宝颗粒（鲁药制字20120030199），主要组成：枸杞子、熟地黄、当归、菟丝子、白芍、党参、黄柏、陈皮等。

主要仪器、设备及试剂：LightCycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪（美国Roche集团），NanoDrop2000微量紫外可见分光光度计（美国Thermo Scientific公司），MilliQ plus超纯水系统（Millipore），高温烤箱（上海市实验仪器总厂），Eppendorf冷冻离心机（OUPONT），Polytron（IKA○R-WERKE），Storm680扫描仪（Molecular Dynamics）恒温水浴槽（Joudan,LKG Bromma），微波炉（格兰仕），REFI-PORT德国罗兰眼电生理仪，TRIZOL试剂（GIBCO-BRL公司）；RNA LA PCR TM kit（AMV）试剂盒（TaKaRa公司）；25%戊二醛（郑州雅盛电子科技有限公司），SYBR○RPremix Ex Taq TM（Perfect Real Time）试剂盒（TaKaRa公司）。1.2实验方法

1.2.1形觉剥夺弱视模型制备左眼造模。手术前30 min肌肉注射阿托品注射液0.04 mg/kg，肌肉注射氯胺酮注射液麻醉（20 mg/kg）。麻醉效果欠佳者可适当加大氯胺酮用量，固定幼猫，应用庆大霉素注射液冲洗结膜囊，常规碘伏消毒术眼，参照文献〔2〕中所述方法施行改进的眼睑缝合术：剪除上下睑缘各1.5 mm，睑裂的颞侧皮肤上做一个水平单纯缝合，打结后剪掉短线头，用带针的长线从上睑缘进针，平行睑缘距该点3 mm处的睑缘内侧缘处出针，进针深度约3 mm，再从下睑缘的相应位置进针，沿睑缘向鼻侧平移3 mm，从下睑缘的内侧缘出针，再在上睑缘相同的位置进针，拉紧缝线，直到内眦侧，最后一针采用上游双线打结，涂适量红霉素眼膏，待幼猫苏醒后送回动物房。造模幼猫1周后拆除左侧造模眼的缝线，行图形视觉诱发电位（pattern visual evoked potential,P-VEP）检查。方法：肌肉注射氯胺酮（15mg/kg）麻醉后，置于固定仪上，结膜囊内滴入1%阿托品扩大瞳孔并收缩瞬膜，剃除幼猫额部、枕部及右耳背的毛，在电屏蔽暗室内进行实验。检影验光，矫正屈光不正，调整受检眼，使视网膜中央区对准视屏中央视标，角膜顶点距视屏40 cm，查左眼，每次记录时间20～30 min，采用方格图形翻转刺激，其平均亮度50 cd/m2，面积相当于视屏12°×12°，空间频率0.16 c/d，时间频率1 Hz，对比度57%，放大器通频带0.5～100 Hz，分析时间250 ms，叠加128次，采用银针电极，采集的信号送入计算机处理存盘。测量P波潜伏期、振幅，参照文献〔3〕的结果，以潜伏期≥55.50 ms，振幅≤30.91 μV为造模成功。造模成功后左侧眼不予缝合。

1.2.2实验分组及干预方法将实验动物采用简单随机分配法分为6组，分别为正常组、模型组、生理盐水对照组，以及视明宝低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组5只。除正常组外其余各组均按照实验模型制备方法予左侧眼造模。模型组造模1周后取脑组织；对照组造模1周后每日灌胃一次2 ml 0.9%氯化钠溶液1个月，低剂量组、中剂量组和高剂量组造模1周后分别给予剂量依次为1.39 g/kg，2.79 g/ kg，5.58 g/kg视明宝颗粒灌胃，根据每只猫的体质量称取相应质量的视明宝颗粒，溶解在2 ml的0.9%氯化钠溶液中，每日1次，连用1个月。对照组、视明宝颗粒低、中、高剂量组灌胃给药后1个月后取脑组织，正常组正常饲养1个月后取脑组织。

1.2.3实验取材水合氯醛深度麻醉幼猫后，快速断头，取脑组织。将脑组织置于冰的0.9%氯化钠溶液中，迅速切取双侧视皮质17区和21a区，用焦碳酸二乙酯水处理过的冰0.9%氯化钠溶液冲洗视皮质后，放入冻存管，液氮内保存。

1.2.4实时定量PCR（real-time PCR）检测NMDAR1 mRNA所用内参照基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH）。提取总RNA，从总RNA反转录得到cDNA，引物序列为：（1）NMDAR1：forward primer：5’-GTG ACC ACT GGC CTG TTC TTC-3’，reverse primer：5’-CGT CTT GTC CAG GTC TTC CAT-3’；（2）GAPDH：forward primer：5’-GAG ATC CCG CCA ACA TCA AAT-3’，reverse primer：5’-GTT CAC GCC CAT CAC AAA CAT-3’。具体步骤：Trizol法提取总RNA，根据试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA。建立20 μl PCR反应体系：2×Master Mix 10.0 μl、水6.0 μl、引物2.0 μl、cDNA 2.0 μl。反应条件为：95℃预变性5 s；95℃变性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸10 s，扩增45个循环；95℃变性5 s，65℃延伸60 s，97℃酶瞬间灭活；40℃冷却10 s。数据采用2-ΔΔCt法计算出模型组与对照组间对应基因的表达差异。

1.3统计学方法

所有数据采用IBM SPSS Statistics 23软件进行分析，各组计量资料经Shapiro-Wilk检验均服从正态分布（P＞0.05），用均数±标准差表示。经Levene检验，各组幼猫左侧17区、21a区及右侧21a区NMDAR1 mRNA表达方差不齐（P＜0.05），各指标的多组间差异比较采用Kruscal-Wallis检验；双侧同一脑区mRNA比较采用配对t检验。所有检验方法均采用双尾检验，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1正常组幼猫与弱视模型幼猫P-VEP比较

弱视模型幼猫P-VEP与同期正常幼猫左眼PVEP相比较，P波潜伏期延长，波幅降低（P＜0.001）（表1）。2.2视皮质17区、21a区NMDAR1 mRNA表达比较

表1 形觉剥夺弱视幼猫造模后与同期正常幼猫左眼P-VEP比较（x±s）

模型组双侧17区、21a区的NMDAR1 mRNA表达均较正常组明显降低（P＜0.05），生理盐水对照组、视明宝低剂量组各脑区指标与模型组接近（P＞0.05）；中剂量组在左侧21a区的表达相对较高，与正常组接近（P＞0.05），其余检测部位数值与模型组、生理盐水对照组及视明宝低剂量组相当（P＞0.05）；高剂量组双侧21a区NMDAR1 mRNA表达高于其他干预组并与正常组接近（P＞0.05），左侧17区数值与各干预组大致相同（P＞0.05），低于正常组（P＜0.05），右侧17区数值高于其他干预组（P＜0.05），也高于正常组（P＜0.05）。具体见表2，图1。

双侧自身配对比较，在17区，视明宝高剂量组的右侧NMDAR1 mRNA表达明显高于左侧（左侧-右侧=-0.42±0.19，P=0.043），其他各组双侧差异不明显（P＞0.05）；21a区，正常组、模型组、生理盐水对照组、视明宝低剂量组，右侧高于左侧（P＜0.05），高剂量组右侧低于左侧（P＜0.05）。具体见表3。

3 讨论

弱视视觉发育的可塑性的研究主要集中在视觉神经系统的各种递质及其受体，近年来现代医学从形态学、分子神经生物学等角度研究探讨敏感期内单眼剥夺对视皮质神经元发育的影响。研究发现单眼剥夺的效应主要发生在视中枢系统，亦从形态学与生理学的实验研究中得到了证实〔4-6〕，其中的离子型受体——N-甲基-D-天门冬氨酸受体（NMDAR）

表2 实时定量PCR检测各组幼猫视皮质17区、21a区NMDAR1 mRNA的相对表达量（x±s）

图1 各组幼猫视皮质不同区域NMDAR1 mRNA相对表达量的箱式图NMDAR1：N-甲基-D-天冬氨酸受体1

表3 表2各组双侧NMDAR1 mRNA相对表达量差值及配对假设检验结果（x±s）

注：NMDAR1 mRNA/GAPDH mRNA。组间比较采用Kruscal-Wallis检验，两两比较，字母上标相同者P＞0.0.5 PCR：聚合酶链反应NMDAR1：N-甲基-D-天冬氨酸受体1 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶在视皮层可塑性发育中发挥着重要作用〔7〕。NMDAR是调节突触可塑性的关键进程，是诱导长时程增强（LTP）/长时程抑制（LTD）的基本因素〔8-9〕。NMDAR在视皮质发育过程中可塑性的调控、诱导c-fos基因的表达、成年后视皮层神经元突触联系的可塑性的调节及与蛋白激酶C的相互作用中都起着重要作用〔10〕。弱视的发病机制中谷氨酸及其受体扮演着重要的角色，尤其是NMDAR1起着重要作用〔11〕。Murphy等〔12〕通过动物实验研究发现，单眼剥夺性弱视，剥夺眼输入层NMDAR1表达下降。

弱视属于中医小儿“通睛”“胎患内障”“小儿青盲”等范畴，中医治疗弱视已经积累了丰富的临床经验〔13〕，但对中药治疗弱视的作用机理研究较少。《外台秘要》曰：“黑白分明，肝管无滞，外托三光，内因神识，故有所见。”《灵枢·海论》曰：“髓海有余，则轻劲多力，自过其度，髓海不足，则脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，懈怠安卧。”《灵枢·邪气藏府病形》曰：“十二经络，三百六十五络，其血气皆上于面而走空窍，其精阳气上走于目而为睛。”其中“内因神识”“髓海”“其精阳气”即是指大脑、中枢系统对视觉的作用。视明宝颗粒源于我院已故全国名老中医衣元良主任医师总结多年治疗弱视的经验，衣老认为弱视的病机为脾胃虚弱、肝肾精亏、气血不足，自拟经验方以健脾益气，补益肝肾，养血为治疗原则，在临床和实验研究中都取得了很好的疗效。本研究比较了正常发育幼猫、单眼形觉剥夺性幼猫及在给予不同剂量的视明宝颗粒后视皮层17区、21a区中NMDAR1的表达情况时发现，正常组的NMDAR1表达明显高于生理盐水组、模型组，说明NMDAR1在幼猫视觉发育过程中起着重要的作用。高剂量组形觉剥夺性弱视猫右侧视皮层17区NMDAR1、双侧视皮层21a区NMDAR1 mRNA表达高于模型组和生理盐水组，说明足量的视明宝颗粒能够提高形觉剥夺性弱视猫视皮质17区及21a区NMDAR1的数量。同一脑区左、右侧视皮质17区NMDAR1比较，高剂量组右侧明显高于左侧；同一脑区左、右侧视皮质21a区NMDAR1比较，正常组、模型组、对照组、视明宝低剂量组，右侧高于左侧（P＜0.05），可能是足量的中药可以提高弱视眼对侧视皮质17、21a区NMDAR1的表达。但是同一脑区左、右侧视皮质21a区NMDAR1比较，高剂量组右侧却低于左侧（P＜0.05），可能与实验的误差有关。同一脑区左右侧比较研究较少，希望在今后的科研中进一步研究。

综上所述视明宝颗粒可以提高敏感期内形觉剥夺性弱视猫视皮质17、21a脑区的NMDAR1 mRNA表达，提示了该药的部分疗效机制。对于视明宝颗粒是否能兴奋神经元突触，诱导神经元突触的发育、存活和分化，逆转弱视的形成，仍需要做进一步的研究。

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Effects of Shimingbao granule on expression of NMDAR1 in visual cortex of cats with form deprivation amblyopia

WANG Gaofeng,CHEN Meirong,XU Kun,et al.Eye Hospital Affiliated to Shandong University of Chinese Medicine,Jinan 250011,China

OBJECTIVETo observe the effects of Shimingbao granule on cats with form deprivation amblyopia in visual cortex area of 17,21a areas by RT-PCR technique.METHODSThirty domestic cats(4-6 weeks) were randomly divided into six groups as normal group,model group,control group,low dose group,medium dose group,high dose group evenly.In addition to the normal group,cats in other groups were all sutured the left eyelid to establish form deprivation amblyopia model.The visual evoked potential(P-VEP)was applied to verify the success of the modeling.The expression of Shimingbao granule in the visual cortex glutamate receptors(NMDAR1)was detected by real-time quantitative PCR(real-time PCR)technique.RESULTS1.When compared with the amblyopic model cats,P-VEP of the normal cats showed longer incubation period and lower amplitude of P.2.In contrast to normal group,the expression of NMDAR1 mRNA in model group was lower(P＜0.05)in both sides of area 21a and 17.Indexes of the control group which were administrated with normal saline,the low dose group which were medicated with Shimingbao granule and the model group were close(P＞0.05).Expression of the left side of area 21a in middle dose group was closed to the normal group(P＞0.05),while expressions of other areas in that group were similar to model group,control group and low dose group(P＞0.05).The expression of NMDAR1 mRNA in the two sides of the area 21a in high dose group washigher than other intervention groups and was similar to results of normal group(P＞0.05);the index of the left area 17 was closed to other intervention groups(P＞0.05)but lower than normal group(P<0.05);the index of the right area 17 was higher than normal group(P<0.05).3.Intra-group comparison between two sides showed that in the area 17,expression of NMDAR1 mRNA at the right side was higher than the left in high dose group(P=0.043).The expressions of two sides in other groups were of insignificant difference(P＞0.05).In the area 21a,expression at the right side was higher than the left in normal group,model group,control group and the low dose group(P＜0.05),while expression of the right was lower than the left in the high dose group(P＜0.05).CONCLUSIONSShimingbao granule could increase the expression of NMDAR1 of the cats with form deprivation amblyopia and the high dose group received the most significant effects.

form deprivation amblyopia;visual plasticity;traditional Chinese medicine;NMDAR1(N-methyl-D-aspartic acid receptor 1)

R285.5

：A

：1002-4379（2016）04-0221-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.04.004

山东省科技发展计划项目（2010GSF10257）

1山东中医药大学附属医院眼科，济南250011

2山东省食品药品监督管理局审评认证中心，济南250013

王静波，E-mail：wangjingbosun@163.com