祛风活血丸对EAU大鼠模型Fas/FasL表达的影响

易妙，喻京生，龙辉

祛风活血丸对EAU大鼠模型Fas/FasL表达的影响

易妙1，喻京生2，龙辉1

目的探讨祛风活血丸对实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）大鼠血清Fas、FasL水平的影响。方法将70只Lewis大鼠随机分为空白组（A组），模型对照组（B组），阳性对照组（C组），以及祛风活血丸低、中、高剂量组（D、E、F组）。采用大鼠右后足垫注射含IRBP（光感受器间维生素A类结合蛋白）的PBS溶液+完全弗氏佐剂制作EAU模型，A组大鼠注射无菌生理盐水。造模后各组大鼠灌胃给药，A、B组予生理盐水，C组予熊胆开明片，D、E、F组分别予低、中、高剂量的祛风活血丸。观察大鼠眼部情况变化，并采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测给药后第7天、14天、21天、28天时各组大鼠的Fas、FasL血清浓度。结果1.成功诱发Lewis大鼠的EAU模型，在免疫后不同时间发生临床可见的炎症，造模成功率91.7%（55/60），空白组大鼠无临床可见葡萄膜炎表现。2.空白组各时间点的Fas、FasL血清浓度始终位于较低水平，模型对照组各时间点的Fas、FasL水平均为最高，明显高于空白组（P＜0.01），并有随时间延长逐渐下降的趋势。中、高剂量组各时间点的Fas、FasL水平较为接近，低于同期低剂量组及阳性对照组，与模型组比较下降更为明显（P＜0.05）。结论Fas/FasL介导的细胞凋亡对EAU发病具有重要意义，祛风活血丸能使大鼠血清中Fas、FasL含量明显降低。

祛风活血丸；实验性自身免疫性葡萄膜炎；Fas；FasL；细胞凋亡

葡萄膜炎又称为色素膜炎，是世界重要致盲眼病之一，指发生于葡萄膜、视网膜、视网膜血管及玻璃体的一组炎症性疾病。葡萄膜炎的发病机制目前尚不明确，已知与感染、外伤、遗传、自身免疫反应等因素有关。其中针对人类葡萄膜炎的研究倾向于将内因性葡萄膜炎定义为自身免疫性疾病〔1〕。鉴于此病的特殊性，近年来常用实验性自身免疫性葡萄炎（experimental autoimmune uveoretinitis，EAU）模型作为常用的葡萄膜炎动物模型，由于其特征和临床表现与人类葡萄膜炎的诸多相似之处，成为了研究葡萄膜炎发病机制的重要工具。

祛风活血丸为我院自制中成药，具有祛风清热，养血活血的作用。本研究拟利用EAU大鼠模型，以血清Fas、FasL为指标，观察祛风活血丸对Fas/FasL系统的免疫调节作用的影响，以探讨该药防治葡萄膜炎的机制，为该药的临床应用提供理论依据，具体报告如下。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物及分组健康6~8周龄，体质量150~180 g的Lewis大鼠70只，雌雄各半，经检查健康无眼疾（均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供）。采用随机数字表法将实验动物分为空白对照组10只和EAU模型组60只，将造模成功的55只大鼠，留出5只作为补充组，其余50只大鼠重新采用随机数字法分为5组，包括空白对照组共分为6组，每组10只，分别为：空白组，模型对照组，阳性对照组，以及祛风活血丸低剂量组、中剂量组、高剂量组。

1.1.2实验试剂光感受器间维生素A类结合蛋白（interphotoreeeptor retinoid-binding protein，IRBP）多肽片断（上海生工生物工程股份有限公司合成）、PBS溶液（北京索来宝科技有限公司）、弗氏完全佐剂（美国Sigma公司）。ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）、水合氯醛、4%多聚甲醛（美国Biosharp）。

1.1.3实验用药（1）祛风活血丸：由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。药物配比为熟地黄20g、当归15 g、川芎6 g、柴胡10 g、黄芩10 g、菊花10 g、防风10 g、鱼腥草20 g。以粉碎机粉碎，并由我校制剂室加工成1 g/ml的悬浮液，置于4℃冰箱中保存。（2）熊胆开明片：吉林长白山药业集团股份有限公司，主要成分为熊胆粉、石决明、菊花、枸杞子、泽泻、茺蔚子、龙胆，每片含药量0.35 g。

1.2实验方法

1.2.1动物模型的制作参照文献〔2〕方法制作EAU大鼠模型。以1 mg IRBP粉剂与1 ml PBS混合调制成浓度为1 mg/ml的含IRBP的PBS溶液，放置备用。以5 ml注射器连通三通阀，分别注入0.6 ml含IRBP的PBS溶液、1.4 ml单纯PBS溶液，2 ml完全弗氏佐剂，反复推注直到充分乳化，制成4 ml混合乳剂。实验组每只大鼠于右后足垫中部皮下进针，缓慢推注0.2 ml的混合乳剂1次，空白组大鼠右后足垫注射等剂量无菌生理盐水1次。每天同一时段在裂隙灯下观察大鼠眼前节改变，详细记录。以出现结膜充血水肿、角膜缘血管充血、虹膜血管扩张、前房渗出、晶状体前囊有灰白色絮状沉着物、虹膜后粘连、瞳孔膜闭以及玻璃体混浊等症状的大鼠作为EAU模型大鼠。

1.2.2分组给药根据Meeh-Rubner公式，即A（体表面积m2）=K×W（2/3）/10 000（K：大鼠常数9.1；人常数10.6；W：体质量，g），推算出大鼠的体表面积，换算出相当于成人等效的治疗剂量。造模后第7天开始给药，空白组、模型对照组以生理盐水4 ml灌胃；低剂量组、中剂量组、高剂量组分别以祛风活血丸2 g/（kg·d）、3 g/（kg·d）、4 g/（kg·d）灌胃；阳性对照组以熊胆开明片0.5 g/（kg·d）灌胃，每日2次。

1.2.3取材及检测于给药后第7天、14天、21天、28天分批处死动物，每组处死2只。每组剩余2只大鼠于第30天以内毒素诱发复发葡萄膜炎后处死。将大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后取其静脉血，所有血标本储存于真空采血管中，以3000 r/min离心15 min后取其血清置于-80℃冰箱保存备用，标本无溶血及絮状沉淀。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清Fas、FasL浓度（具体测定方法参照说明书）。

1.3统计学处理

采用SPSS 17.0对数据进行分析，计量资料采用均数±标准差表示，各组不同时间Fas、FasL血清浓度比较采用重复测量资料的方差分析，同一时间组间总体差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1EAU模型表现

裂隙灯下每日观察大鼠眼部，空白组无炎症反应；EAU模型组造模后出现一系列炎症反应，与葡萄膜炎一致。最早于造模后第4天观察到炎症反应，表现为角膜缘血管充血，虹膜血管轻度扩张（图1）；于造模后第5天出现葡萄膜炎反应，表现为不同程度前房混浊及角膜后沉着物（KP），房水闪光（+），瞳孔缩小，红光反射减弱，部分出现晶状体前灰白色絮状物；于造模后第14天炎症达到高峰，开始出现瞳孔缘灰白色絮状物，前房变浅，房水混浊，角膜后KP，瞳孔膜闭等体征（图2）。注射的60只大鼠共有55只出现不同程度的葡萄膜炎反应，造模成功率为91.7%。2.2Fas血清浓度变化

图1 EAU模型大鼠裂隙灯像。1A.造模第4天眼部炎症情况；1B.造模第14天眼部炎症情况EAU：实验性自身免疫性葡萄炎

不同组大鼠的血清Fas浓度以及各组大鼠整体上不同时间的血清Fas浓度均存在统计学意义的差异（重复测量资料的方差分析，F分组=12.770，P= 0.004；F时间=34.246，P＜0.001；F交互作用=1.663，P= 0.151）。空白组各时间点的Fas血清浓度始终位于较低水平，模型组各时间点的Fas水平均为最高，明显高于空白组（P＜0.01），并有随时间延长逐渐下降的趋势。其余各组各时间点血清Fas浓度低于模型组，与模型组比较差异有统计学意义的包括：阳性对照组给药后第14天（P=0.004）、第21天（P=0.025）、第28天（P=0.002）；低剂量组给药后第14天（P= 0.001）、第28天（P=0.003）；中剂量组给药后第7天（P=0.042）、第14天（P=0.000）、第21天（P=0.001）、第28天（P=0.000）；高剂量组给药后第14天（P= 0.000）、第21天（P=0.001）、第28天（P=0.001）。与阳性对照组比较差异有统计学意义的包括：中剂量组给药后第14天（P=0.004）、第21天（P=0.015）；高剂量组给药后第14天（P=0.007）、第21天（P=0.024）；与低剂量组比较差异有统计学意义的包括：中剂量组给药后第14天（P=0.015）、第21天（P=0.008）；高剂量组给药后第14天（P=0.032）、第21天（P= 0.012）。总体上，中、高剂量组各时间点的Fas水平较为接近，低于同期低剂量组及阳性对照组；中剂量组各时间点数值低于高剂量组，但两组间差异不大（P＞0.05）（表1，图2）。提示祛风活血丸可以减少EAU大鼠血清中Fas的表达，且以中、高剂量组最为明显。

2.3FasL血清浓度变化

图2 各组大鼠给药后不同时间血清Fas浓度（ng/ml）的变化情况

表1 各组大鼠给药后不同时间血清Fas浓度变化情况（x±s，ng/ml）

各组大鼠不同时间的血清FasL浓度总体差异不同（重复测量资料的方差分析，F分组=73.455，P＜0.001；F时间=84.876，P＜0.001；F交互作用=6.587，P＜0.001）。空白组的FasL血清浓度始终较低，模型组FasL血清水平最高，两组各时间点的差异明显，统计学比较均有意义（P＜0.01）。与阳性对照组比较差异有统计学意义的包括：低剂量组给药后第7天（P=0.009）；中剂量组给药后第7天（P＜0.001）、第14天（P＜0.001）、第21天（P=0.004）、第28天（P= 0.002）；高剂量组给药后第7天（P=0.001）、第14天（P=0.001）、第21天（P=0.003）、第28天（P=0.001）；与低剂量组比较差异有统计学意义的包括：中剂量组给药后第7天（P=0.004）、第14天（P=0.002）、第21天（P=0.018）、第28天（P=0.014）；高剂量组给药后第7天（P=0.028）、第14天（P=0.005）、第21天（P=0.010）、第28天（P=0.007）（表2，图3）。提示祛风活血丸亦可减少EAU大鼠血清中FasL的表达，中、高剂量组的药效最为明显。

表2 各组大鼠给药后不同时间血清FasL浓度变化情况（x±s，ng/ml）

图3 各组大鼠给药后不同时间血清FasL浓度（ng/ml）的变化情况

3 讨论

葡萄膜炎多发生于青壮年，易合并全身性自身免疫性疾病，常反复发作，可引起一些严重并发症甚至致盲。葡萄膜炎分类方法繁多，可以分为感染性和非感染性两大类，除开感染性因素之外，目前认为，葡萄膜的发病主要与免疫相关〔3〕。EAU是研究人类葡萄膜炎乃至全身自身免疫性疾病的一种实验动物模型，其模型表现特征性强，可重复，易于观察与记录，是药物治疗评估的理想模型〔4〕。本实验证明IRBP能在Lewis大鼠上成功诱发葡萄膜炎，累及角膜、虹膜、睫状体等部位，出现一系列的炎症反应，并且随着时间的推移，炎症愈发加重，所以本研究制作的EAU模型是成功的。

大多数葡萄膜炎是由于自身抗原突破血-眼屏障，打破视网膜的免疫特赦所致。这些自身抗原被T细胞接收，从而引起针对自身抗原的免疫反应〔5〕，已经证实T细胞表面Fas/FasL表达的平衡性与葡萄膜炎的发病有关。Fas抗原又称Apo-1 CD95，属于TNF（肿瘤坏死因子）/NGF（神经生长因子）受体超家族成员，FasL是Fas在人体内的天然配体，可与Fas特异性结合，也属于TNF/NGF超家族成员。二者结合向细胞内传导死亡信号，诱导激活的T淋巴细胞凋亡。有研究表明，EAU过程中有大量炎症细胞凋亡，眼组织中浸润细胞的凋亡可能是标志EAU开始消退的最初征象之一。杨培增等〔6〕发现在EAU中，虹膜、睫状体、视网膜、脉络膜上不仅发生炎症反应，也出现炎症细胞的凋亡，推测此炎症之所以迅速消退，可能与浸润的炎症细胞快速凋亡有关。在本实验研究中发现无论是空白组还是药物干预组均可见到Fas、FasL的表达，但是模型组的Fas、FasL表达明显高于空白组，且随着炎症的高峰期到来也表达增多，经过药物干预后，各药物组Fas、FasL出现不同程度下降，其中以祛风活血丸中、高剂量组最为明显。同时，模型组中亦可见到Fas、FasL也呈下降趋势。因此，我们认为，EAU模型属于T细胞介导的器官特异性自身免疫病，在这个过程中炎症细胞释放大量炎症因子，从而刺激眼内组织中Fas表达，与配体FasL相结合诱导细胞发生凋亡，从而破坏正常组织结构。随着炎症高峰期到来，Fas、FasL表达增多，与炎症反应呈正相关，但伴随着时间延长，有自行下降的倾向，且药物组与模型组相比较，Fas、FasL表达的下降幅度更明显，这表明药物干预加快了Fas、FasL下降的速度，加速了炎症消退时间，从而达到治疗效果，这可能与其促进细胞凋亡相关。

葡萄膜炎多见风热外袭。肝开窍于目，肝主疏泄，若情志不畅，则肝气郁结，郁而化火，火热之邪上扰于目；风为阳邪，“伤于风者，上先受之”，目居于上位，易受风邪侵袭。风邪易挟它邪，热邪亦属阳邪，同气相求，故风热之邪常合而侵袭眼目。同时考虑到葡萄膜多气多血，炎症时易造成局部瘀滞，因此气滞血瘀为其常见的病理改变，基本病机为外感风热，气滞血瘀。阳性对照组选用中成药熊胆开明片，各药配伍，具有清肝泄热，滋阴明目的作用，研究显示熊胆开明片对白内障术后并发症及急性虹膜睫状体炎具有很好地疗效〔7-9〕。治疗组药物选用湖南中医药大学第一附属医院院内制剂祛风活血丸，主要组成为熟地黄、当归、川芎、柴胡、黄芩、菊花、防风、鱼腥草等。方中熟地黄滋阴补血，当归养血和血，川芎行血活血，熟地黄乃血中之血药，当归、川芎为血中之气药，可收补而不滞之效；黄芩、鱼腥草清热解毒；柴胡疏肝解郁；菊花清肝明目；防风祛风止痛；药少功强，共奏祛风清热、行气活血之功效。在前期研究中，李维等〔10〕发现祛风活血丸能够明显降低白内障术后迟发型葡萄膜炎的发生率，且能缓解眼局部症状；肖霞等〔11〕在西医基础上加用祛风活血丸治疗葡萄膜炎，发现中西结合疗效佳；曾静等〔12〕对祛风活血丸治疗前葡萄膜炎疗效观察，结果显示该药既能提高疗效，又能减少复发，值得推广应用。故本实验选用祛风活血丸对EAU大鼠进行干预，实验结果表明祛风活血丸可以减少实验性自身免疫性葡萄膜炎Fas、FasL的表达，且以中、高剂量组的治疗效果最好，我们因此推测祛风活血丸可通过调整Fas/FasL系统的平衡性，从而促进活化的淋巴细胞迅速凋亡，降低炎症反应的程度。

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Functions of Huoxue Pill on EAU Rats Model of Fas/FasL Expression Effect

YI Miao，YU Jingsheng，LONG Hui.Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410208，Hunan，China

OBJECTIVEExplore the functions of huoxue pill on experimental autoimmune uveitis（EAU）serum level of Fas and FasL in rats.METHODS0 Lewis rats were randomly divided into blank group（group A），model control group（group B），positive control group（group C），as well as the functions of huoxue pill low，medium and high dose group（group D，E，F）.Using the right rear foot pad injection in rats including IRBP（vitamin A binding protein）between photoreceptor of PBS solution+make EAU model complete freund's adjuvant，group A sterile saline injection in rats.After building groups of rats lavage，A，B group with physiological saline，group C to bear bile enlightened，D，E，F group to low，medium and high doses of the functions of huoxue pellet.Observation rat eye situation changes，and using enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）method to detect drug delivery after 7 days，14 days，21 days，28 days between groups of Fas and FasL in rats serum concentration.RESULTS1.The EAU successfully induce Lewis rats model，clinical visible at different time before and after the immune inflammation，building success rate 91.7%（55/60），blank group rats without clinical visible uveitis.2.Each time point blank group serum concentrations of Fas and FasL always located in the lower level，model control group of each time point was the highest level of Fas and FasL，significantly higher than the blank group（P<0.01），and has a tendency to extend gradually decreases with time.Each point in time，the high dose group of Fas and FasL level is relatively close，lower than the same period and low dose group and positive control group，compared with model group decreased more significantly（P<0.05）.CONCLUSIONSFas/FasL mediated apoptosis of EAU incidence is of great significance and functions of huoxue pill can make the rats serum content of Fas and FasL decreased obviously.

functions of huoxue pill；experimental autoimmune uveitis；Fas；FasL；cell apoptosis

R285.5

：A

：1002-4379（2016）04-0226-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.04.005

国家自然科学基金项目（81273808/H2713）

1.湖南中医药大学（2014级硕士研究生），长沙410208

2.湖南中医药大学第一附属医院，长沙410007

喻京生，E-mail：yujingsheng-mike@163.com