BLCAP基因干扰表达载体的构建及对膀胱癌细胞系T24增殖的影响

李显文 钟朝晖 付春花 陆新升 张斌 罗锦斌 曾灿



·短篇论著·

BLCAP基因干扰表达载体的构建及对膀胱癌细胞系T24增殖的影响

李显文 钟朝晖 付春花 陆新升 张斌 罗锦斌 曾灿

有研究发现抑癌基因BLCAP基因特异性表达于肌层非浸润性膀胱癌病灶中，而在浸润性膀胱癌中该基因表达下降[1-2]。本研究在成功构建膀胱癌相关性抑癌基因BLCAP基因干扰表达载体的基础上，进一步研究BLCAP基因干预对膀胱癌细胞系T24增殖的影响。报告如下。

材料与方法

一、材料与试剂

血/细胞DNA抽提和质粒预提纯试剂盒(湖南艾佳生物科技股份有限公司)，pcDNA3.1载体(美国Ambion)，T4DNA连接酶(北京康为世纪生物科技有限公司)，限制性内切酶和10×Tango缓冲液(立陶宛Fermentas)，Lipo2000(美国Invitrogen)，MTT(上海生物工程有限公司)，T24细胞株(中科院上海细胞库)，引物合成及阳性克隆测序由华大基因科技有限公司完成。

二、干扰载体的线性化

1.质粒载体：选择pcDNA3.1质粒为BLCAP基因载体。

2.引物设计：h-BLCAP-F：5′CCC AAGCTT ATGTATTGCCTCCAGTG 3′(Hind III)；h-BLCAP-R：5′CCG GAATTC TTAGGTGCCCACAA 3′(EcoR I)。

3.目的基因PCR扩增：反应体系每管100 μl，含2×HS液 50 μl、上游引物(10 μmol/L)5 μl、下游引物(10 μmol/L)5 μl、DNA模板5 μl、ddH2O 35 μl。吹吸混匀，离心15 s。PCR程序设置：95 ℃变性5 min后进入PCR循环。95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环，再行72 ℃延伸7 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定其与目的片段大小一致后，切取并回收。

4.酶切：①质粒酶切反应体系：pcDNA3.1(0.5 μg/μl)4 μl，10×Tango缓冲液5 μl，EcoR I(10 U/μl)2 μl，Hind III(10 U/μl)2 μl，H2O补至50 μl。将上述混合的反应物置于37 ℃，孵育4 h。② PCR产物反应体系：PCR产物37 μl，10×Tango缓冲液5 μl，EcoR I(10 U/μl)1 μl，Hind III(10 U/μl)1 μl，H2O补至50 μl。将上述混合的反应物置于37 ℃，过夜孵育。

5.回收纯化及连接：条带单一的PCR产物可直接进行回收(使用循环纯化试剂盒，美国OMEGA)。连接操作时将所需试剂置于冰上，按试剂盒说明书进行(过程略)。

6.连接后产物转化、培养及提取菌液行PCR检测：连接后产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后挑取单克隆，随后进行菌液PCR鉴定(过程略)。如载体成功重组，PCR扩增产物行凝胶电泳时可见264 bp的单一条带。

将PCR条带与目的产物大小一致的克隆送华大基因公司测序，通过测序峰图进行核对，证实插入片段为BLCAP片段，且无碱基突变，说明pcDNA3.1-BLCAP过表达载体构建成功。选取测序结果正确的克隆，扩大培养后，提取质粒。

三、RT-PCR法检测T24细胞在重组载体转染前后BLCAP基因的表达情况

实验分为3组：重组载体组(pcDNA3.1-BLCAP)、空载体组(pcDNA3.1-NC)及空白对照组(Con，无质粒)，每组3个样本。RT-PCR法检测：检测体系每管20 μl，设定程序为两步法Real-Time定量，预变性95 ℃，3 min，之后每一步变性95 ℃，10 s，BLCAP、β-actin、U6引物60 ℃退火延伸30 s，共进行40个循环，每次在延伸阶段读取荧光值。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析(过程略)。

四、MTT检测BLCAP对膀胱癌细胞系T24增殖能力的影响

分别将pcDNA3.1-NC、pcDNA3.1-BLCAP质粒转染膀胱癌细胞株(T24)后，通过MTT法检测其对细胞增殖能力的影响。因在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数呈正比，所以可根据测得的吸光度值(即OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。实验分为3组：重组载体组(pcDNA3.1-BLCAP)、空载体组(pcDNA3.1-NC)及空白对照组(Con)，每组5个样本，选择转染后0、24、48和72 h为检测节点，过程略。

五、统计学方法

本研究结果为3组计量资料样本，且需行组间两两比较，故统计学方法采用单因素多个样本均数比较(成组设计)，在样本均数方差齐性分析的基础上，组间两两比较，需行q检验(Newman-Keuls法)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、RT-PCR法检测T24细胞在重组载体转染前后BLCAP基因的表达情况

重组载体组BLCAP基因含量为3.072 5，明显高于空载体组及空白对照组(分别为1.159 7和1.015 0)，表明BLCAP重组载体成功构建。

二、MTT检测BLCAP对膀胱癌细胞系T24增殖能力的影响

检测结果表明，转染24 h后至72 h重组载体组细胞增殖明显低于空白对照组和空载体组(P<0.01)，空白对照组和空载体组转染前后细胞增殖无明显差异(P>0.05)。见图1、表1。

图1 T24各组细胞MTT结果(OD值)

表1 T24各组细胞OD值均数两两比较的q检验(Newman-Keuls法)

讨 论

业已明确肿瘤或者癌症发生和演进的主要原因和机制源于癌基因的激活、抑癌基因的失活和肿瘤细胞的抗凋亡活性增高。研究表明，膀胱癌发生时通常伴发有多种抑癌基因的失活(如广为人知的p53基因、Rb基因)，其中也包括本研究涉及的抑癌基因BLCAP。

2002年报道发现，BLCAP基因特异性表达于肌层非浸润性膀胱癌病灶中，而在浸润性膀胱癌中该基因表达下降[1-2]。2009年Moreira等[3]通过大样本的研究，进一步证实了膀胱癌的进展与BLCAP基因的表达缺失有关，认为BLCAP基因是膀胱癌的一个潜在的预后标志物。Baffa等[4]较详细论述了BLCAP在膀胱癌诊断和治疗目标中的分子遗传学机制。相比国外研究情况而言，膀胱癌与BLCAP基因的相关性研究在国内尚未见有报道。对其进行更深入的研究，对阐明膀胱癌的发生和演进机制，开拓膀胱癌基因治疗的新靶点等都有重要的意义。

本研究中我们运用分子和细胞生物学技术，成功构建了BLCAP基因质粒重组载体--pcDNA3.1-BLCAP。随后的转染实验结果表明，人膀胱癌细胞T24转染pcDNA3.1-BLCAP后24 h，MTT检测该组样本的OD值均数为0.622，显著低于空白对照组(0.741)的和空载体组(0.724)(P<0.01)，而空白对照组和空载体组间OD值差异无统计学意义(P>0.05)；转染后48 h和72 h，重组载体组的OD值均数分别为0.837和1.031，亦显著低于空白对照组(1.038、1.228)和空载体组(1.010、1.191)(P<0.01)，空白对照组和空载体组间OD值差异亦无统计学意义(P>0.05)。本研究初步表明，人膀胱癌T24细胞在成功转染BLCAP基因后癌细胞的增殖速度明显减慢，BLCAP基因在膀胱癌中具有抗肿瘤效应，因此以BLCAP基因为靶点的基因治疗是初步可行的，BLCAP基因有望成为膀胱癌基因治疗的新靶点。

[1] Ratliff TL.bc10: a novel human bladder cancer-associated protein with a conserved genomic structuredownregulated in invasive cancer[J].J Urol,2002,168(2):884-885.

[2] Gromova I, Gromov P, Celis JE.bc10: A novel human bladder cancer-associated protein with a conserved genomic structure downregulated in invasive cancer[J].Int J Cancer,2002,98(4):539-546.

[3] Moreira JM, Ohlsson G, Gromov P, et al.Bladder cancer-associated protein, a potential prognostic biomarker in human bladder cancer[J].Mol Cell Proteomics,2010,9(1):161-177.

[4] Baffa R, Letko J, McClung C, et al.Molecular genetics of bladder cancer: targets for diagnosis and therapy[J].J Exp Clin Cancer Res,2006,25(2):145-160.

(本文编辑：熊钰芬)

2013深圳市南山区科技计划项目(医疗卫生类)(2013044)

518000 深圳市蛇口人民医院泌尿外科(李显文、陆新升、张斌、罗锦斌、曾灿)；中南大学湘雅二医院泌尿外科(钟朝晖)；北京大学深圳医院ICU(付春花)

李显文，E-mail:xianwen_li@sina.com

10.3870/j.issn.1674-4624.2016.04.011

2016-06-06)