超高效液相色谱法测定护肝布祖热颗粒中秦皮乙素含量

黄耀广，陈秀英

（1.新疆维吾尔自治区喀什地区食品药品检验所，新疆 喀什 844000； 2.新疆维吾尔自治区喀什地区疾病预防控制中心，新疆 喀什 844000）

超高效液相色谱法测定护肝布祖热颗粒中秦皮乙素含量

黄耀广1，陈秀英2

（1.新疆维吾尔自治区喀什地区食品药品检验所，新疆 喀什 844000； 2.新疆维吾尔自治区喀什地区疾病预防控制中心，新疆 喀什 844000）

目的 建立测定护肝布祖热颗粒中秦皮乙素含量的超高效液相色谱（UHPLC）法。方法 色谱柱为 Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 m），流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液梯度洗脱，流速为0.21 mL/min，柱温为30℃，检测波长为349 nm，进样量为1 L。结果 秦皮乙素质量浓度在1.06～21.16 g/mL范围内与峰面积线性关系良好（r=0.999 7）；加样回收率为100.65%，RSD为0.97%（n=6）。结论该方法简便、准确，测得结果稳定性、重复性好，可用于该制剂中秦皮乙素含量测定。

含量测定；超高效液相色谱法；秦皮乙素；菊苣；护肝布祖热颗粒

护肝布祖热颗粒是维吾尔医成方制剂中保肝护肝的传统古方，由芹菜子、菊苣子、菟丝子、芹菜根、茴香根皮、菊苣根、小茴香7味药材组方［1］。其具有补益肝、胃，散气止痛，利胆，利水的功效，常用于治疗肝寒、胃痛、脾阻胁痛、关节骨痛及风湿病、泌尿系统疾病，疗效确切，不良反应少，是一种安全有效的药物［2］。原方收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·维吾尔药分册》中，原质量标准过于简单，未收载含量测定方法，故不能很好地对该制剂进行质量控制［1］。本试验中以具有较好保肝活性的秦皮乙素为评价指标［3-5］，建立超高效液相色谱（UHPLC）法测定护肝布祖热颗粒中秦皮乙素的含量测定方法，以完善该制剂的质量控制标准。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ACQUITY型超高效液相色谱仪，ACQUITY型PDA（美国Waters公司），MS205DU型电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Elmasonlc E 100H型高功率超声波清洗器（德国Elmasonlc公司）。

1.2 试药

秦皮乙素对照品（中国药品生物制品检定所，批号为110741-200506）；护肝布祖热颗粒（新疆维吾尔药业有限责任公司，批号分别为141226，140335，1309552）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，甲醇、磷酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈（A）-0.4磷酸%（B），线性梯度洗脱，见表1；检测波长：349 nm；进样量：1 μL；柱温：30℃；流速：0.21 mL/min。在上述色谱条件下，秦皮乙素的保留时间为4.089 min，理论板数按秦皮乙素峰计大于6 000，秦皮乙素峰与相邻峰分离度大于1.5。在此条件下的色谱图见图1。

2.2 溶液制备

取秦皮乙素10.58 mg，精密称定，置200 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品贮备液，质量浓度为 52.90 μg/mL。取样品（批号为 141226），研细，精密称取5 g，加甲醇50 mL超声（功率50/60 Hz）30 min，放冷后过滤，并用20 mL甲醇冲洗残渣，合并提取液，浓缩至近干，用甲醇溶解，定容至10 mL，作为供试品溶液。按护肝布祖热颗粒处方，不加菊苣根、菊苣子，依法制备阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

阴性干扰试验：分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液适量，按拟订色谱条件进样，供试品溶液中，在与对照品溶液色谱相应位置有相同色谱峰，而阴性对照品溶液在相同时间处无此色谱峰，表明阴性对照品溶液对测定无干扰，见图1。

线性关系考察：精密吸取秦皮乙素对照品贮备液（质量浓度为52.9 μg/mL）0.2，0.4，1.0，2.0，4.0 mL，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，按拟订色谱条件进样测定，以对照品溶液的质量浓度（X，μg/mL）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，得秦皮乙素的回归方程 Y=14 833 X-2 304，r=0.999 8（n=5）。结果表明，秦皮乙素质量浓度在1.06～21.16 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

表1 流动相线性梯度洗脱程序

图1 超高效液相色谱图

精密度试验：精密吸取同一秦皮乙素对照品溶液（质量浓度为10.58 μg/mL）1 μL，按拟订色谱条件下重复进样6次，测定，记录峰面积。结果的 RSD为0.43%（n=6），表明仪器精密度良好，详见表2。

表2 精密度试验结果（n=6）

稳定性试验：取同一供试品（批号为141226）溶液1 μL，分别于0，2，4，8，12，24 h时进样测定峰面积。结果的 RSD为1.88%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定，详见表3。

表3 稳定性试验结果

重复性试验：精密称取同一批（批号为141226）样品6份，依法制备供试品溶液，进样测定，并计算含量。结果秦皮乙素平均含量为10.62 μg/g，RSD为1.30%（n=6），表明该方法重复性较好，见表4。

表4 重复性试验结果（n=6）

加样回收试验：精密称取同一批（批号为141226）已知含量的供试品6份，每份4 g，分别精密加入秦皮乙素对照品贮备液（质量浓度为52.9 μg/mL）1.0 mL，依法制备供试品溶液，并按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，按外标法计算含量，计算回收率。结果见表5。

表5 秦皮乙素加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

取3批样品（批号分别为141226，140335，1309552）依法制备供试品溶液，并按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，按外标法计算秦皮乙素的含量，见表6。

表6 护肝布祖热颗粒中秦皮乙素的含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 提取条件选择

本试验考察了不同提取方法（回流、超声）、提取溶剂（50%甲醇、纯甲醇、50%乙醇、纯乙醇）、提取时间（10，20，30，40，50 min）对提取效率的影响。结果用甲醇超声提取30 min效果最佳，回收率完全满足色谱分析的要求。

3.2 测定波长选择

通过二极管阵列检测器对秦皮乙素于210～400 nm波长范围内进行光谱扫描，发现秦皮乙素的最大吸收波长为349 nm，故选择349 nm为该方法的检测波长。经试验，其他成分、溶剂及辅料在该波长下对秦皮乙素的测定均无干扰。

3.3 流动相选择

经多次试验，比较了甲醇-0.4%甲酸、乙腈-0.4%甲酸、甲醇-0.4%磷酸、乙腈-0.4%磷酸等流动相对该制剂中秦皮乙素分离效果的影响，确定乙腈-0.4%磷酸梯度洗脱分离效果良好、峰形对称且阴性样品无干扰［6］。

［1］WS3-BW-0135-98，中华人民共和国卫生部药品标准·维吾尔药分册［S］.

［2］吕 洋.肝炎检测的临床意义和用药指导［J］.中国药物经济学，2014（1）：250-251.

［3］闫 明，黄 毅，刁娟娟，等.菊苣子的理化鉴别研究［J］.时珍国医国药，2006，17（12）：2 447-2 448.

［4］Wu HK，Su Z，Aisa HA，et al.Components of Cichorium glandulosumseeds［J］.Chem Nat Compd，2007，43（4）：472-473.

［5］Wu HK，Su Z，Yili A，et al.Isolation of esculetinfrom Cichorium glandulosum by high-speed counter-current chromatography［J］. Chem Nat Compd，2007，43（1）：109.

［6］胡君萍，迪利拜尔·马木提，李 渊，等.UPLC同时测定维药毛菊苣和菊苣中5种化学成分的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（17）：65.

Content Determination of Aesculetin in Hugan Buzure Granules by UHPLC

Huang Yaoguang1，Chen Xiuying2
（1.Kashgar Food and Drug Administration，Kashgar，Xinjiang，China 844000；2.Kashgar Center for Disease Control and Prevention，Kashgar，Xinjiang，China 844000）

Objective To establish an UHPLC method for the content determination method of aesculetin in Hugan Buzure Granules. M ethods The column was Acquity UPLC BEH C18column（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；the mobile phase was acetonitrile-0.4% phosphoric acid solution，gradient elution；the flow rate was 0.21 mL/min，the column temperature was 30℃，the detection wavelength was 349 nm，the sample volume was 1 μL.Results Aesculetin showed good linear relationship in 1.06-21.16 μg/mL（r=0.999 7），the average recovery rate was 100.65% and the RSD=0.97%（n=6）.Conclusion The method is simple，accurate and reproducible.It can be used for the content determination of aesculetin in the preparation.

content determination；UHPLC；aesculetin；chicory；Hugan Buzure Granules

黄耀广（1979-），男，汉族，大学本科，副主任药师，研究方向为药品质量控制和实验室质量管理，（电话）0998-2822109（电子信箱）359543147@ qq.com。

2016－04－20；

2016－06－16）

R284．1；R286．0

A

1006－4931（2016）19－0056－03