曼陀罗子对小鼠L5178Y细胞TK基因的致突变作用

彭晓明，霍仕霞，高 莉，闫 明

（新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所·新疆维吾尔医方剂学实验室，新疆 乌鲁木齐 830049）

曼陀罗子对小鼠L5178Y细胞TK基因的致突变作用

彭晓明，霍仕霞，高 莉，闫 明

（新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所·新疆维吾尔医方剂学实验室，新疆 乌鲁木齐 830049）

目的 研究曼陀罗子对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因的致突变作用。方法 将培养的小鼠淋巴瘤L5178Y细胞在代谢活化和非代谢活化条件下，分别以62.5，125，250，500 g/mL的曼陀罗总碱或625，1 250，2 500，5 000 g/mL的氢溴酸东莨菪碱处理3 h后，弃细胞上清液，并加入DMEM培养基继续培养48 h。然后将细胞接种于含三氟胸苷的96孔板，计数各组的突变细胞集落数。结果 与对照组比较，在代谢活化和非代谢活化条件下，62.5，125，250，500 g/mL的曼陀罗总碱和625，1 250，2 500，5 000 g/mL的氢溴酸东莨菪碱均未见诱导L5178Y细胞突变率的增加。结论 62.5～500 g/mL的曼陀罗子总碱和625～5 000 g/mL的氢溴酸东莨菪碱对小鼠L5178Y细胞TK基因无致突变作用。

曼陀罗子；氢溴酸东莨菪碱；淋巴瘤细胞；TK基因；突变

曼陀罗子，维吾尔语名为衣提洋克欧如合，为茄科植物曼陀罗 Datura stramonium L.的干燥成熟种子，是维吾尔医民间习用药。该药具有生干生寒、安神止痛、固涩壮阳、催眠消炎等功能，被广泛用于治疗乃孜乐性感冒、头痛、风湿关节痛、早泄滑精、失眠、痔疮、牙周炎等湿热性或血液质性疾病［1］，但若给药剂量控制不当易引起中毒反应。课题组前期研究已证实［2-4］，曼陀罗子及其提取物对小鼠肝、肾功能均具有毒性损伤作用，且生药量超过388 mg/（kg·d）的曼陀罗子提取物亦对Beagle犬的中枢神经系统、血液系统、消化系统、心脏等具有毒性作用。本试验中通过研究曼陀罗子总生物碱提取物和氢溴酸东莨菪碱对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因是否具有致突变作用，旨在为曼陀罗子的安全应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

SW-CJ-1F型超净工作台（苏净安泰），37XAY型倒置荧光显微镜（上海光学六厂），MCO-18AIC型CO2培养箱（Sanyo），酶标仪（ThermoFisher，Multiskan Go 1510）。1.1.2 试药

曼陀罗子总生物碱（DTA）由本实验室自制，制备方法为，曼陀罗子经粗粉后，分别加入5倍、3倍、3倍体积的80%乙醇（pH为3）回流提取3次，每次1 h。提取液过滤浓缩后，加入氨水调节pH至8～9，以1∶1体积比例反复用氯仿萃取至颜色明显变浅，浓缩冷冻干燥至浸膏，利用酸碱滴定法测定总生物碱含量80%以上。然后称取0.1 g的DTA，加入200 μL二甲基亚砜（DMSO）超声溶解，备用。氢溴酸东莨菪碱（SH，批号为LRAA3018）购自Sigma-Aldrich公司。

DMEM（高糖）培养基和马血清为Gibco公司产品。氨苄青霉素钠和硫酸链霉素购自Amersco公司。DMSO、四甲基偶氮唑盐（MTT）、甲基甲烷磺酸乙酯（MMS）、环磷酰胺（CP）均为Sigma-Aldrich公司产品。哺乳动物微粒体酶S9购自上海宝录生物科技有限公司。

1.1.3 细胞株

小鼠淋巴瘤细胞株L5178Y TK+/-clone（3.7.2c）购自中国科学院细胞库。

1.2 方法［5］

1.2.1 L5178Y细胞培养及药物剂量的筛选

L5178Y细胞传代2～3次后，以1 000 r/min离心收集细胞，DMEM培养基（不含血清）调节细胞浓度至1×106个/mL左右，转移至96孔培养板，每孔90 μL。然后分别以15.625，31.25，62.5，125，250，500 μg/mL的DTA及10，100，1 000，10 000 μg/mL的SH作用细胞 24 h。药物作用完成后，每孔加入 5 g/L的 MTT 10 μL，作用4 h后，每孔加入100 μL三联液（10%十二烷基硫酸钠，5%异丁醇，0.012 mol/L HCl），37℃放置过夜。于全波长Multiskan Go 1510酶标仪测定570 nm波长处吸光度值（A），应用公式计算细胞存活率，细胞存活率=A给药/A正常×100%。

1.2.2 DTA和SH对L5178Y细胞致突变的检测

受试药物处理：离心收集L5178Y细胞，以DMEM培养基（含10% 马血清）调节细胞浓度至1×106个/mL左右，转至15 mL离心管（每管10 mL）。除非代谢活化细胞外，所有的代谢活化细胞均需加入200 μL肝微粒体S9混合液。然后将细胞分为DTA 500，250，125，62.5 μg/mL组，SH 5 000，2 500，1 250，625 μg/mL组，阳性药组为5 μg/mL MMS（非代谢活化）和2 μg/mL CP（代谢活化），阴性对照为0.1%的DMSO。上述样品均以2%体积分数加入细胞培养液，然后于37℃摇床震荡处理3 h（振荡频率为7～18次/分）。

细胞平板效率（PE）和相对存活率检测：处理结束后以1 000 r/min离心收集细胞，DMEM培养基重悬细胞，再次离心后吸弃培养基。以DMEM培养基（含10%马血清）调节细胞浓度至2×105个/mL，然后吸取少量的细胞再以DMEM培养基（含20%马血清）稀释至8个/mL细胞悬液，置96孔板，每孔200 μL。于37℃CO2培养箱培养12 d后，计数96孔板中含有细胞集落的孔数，计算平板效率（PE0）。同时，将剩余浓度为2×105个/mL的 L5178Y细胞转入 96孔板，每孔200 μL，于37℃ CO2培养箱表达48 h后，计算第2天的平板效率（PE2）。平板效率（PE）=-ln（EW/TW）/n，EW为不含集落孔数，TW为总孔数，n=1.6。相对存活率（RS0）=PE0test/PE0control。

细胞增长率检测：受试药物和细胞处理结束后，L5178Y细胞经离心、洗涤、再离心后，以DMEM培养基（含10% 马血清）调节细胞浓度至2×105个/mL接种至24孔板中，每孔500 μL。分别在接种后的第1天和第2天进行细胞计数，并计算细胞增长率（DCG）、相对悬浮生长率（RSG）和相对总增长率（RTG）。细胞增长率（DCG）=细胞浓度次日/细胞浓度前日，相对悬浮生长率（RSG）=（DCG1d×DCG2d）test/（DCG1d×DCG2d）control，相对总增值率（RTG）=RSG×RS2。

细胞突变率检测：受试药物和细胞处理结束后，弃细胞上清液，以 DMEM培养基继续培养 48 h后，将L5178Y细胞以DMEM培养基（含20%马血清）调节细胞浓度至1×104个/mL接种至2块96孔板（含3 μg/mL三氟胸苷），每孔200 μL（复孔），于37℃ CO2培养箱培养 10～14 d，计数含有集落的孔数，并计算突变率（MF）。突变率（MF）=-ln（EW/TW）/n/PE2，EW为不含集落孔数，TW为总孔数（192），n=2 000。

1.3 统计学处理

所有数据采用 Mutant软件统计分析。受试药物的突变频率比阴性对照高2倍或以上，可判定为阳性结果。

2 结果

2.1 L5178Y细胞给药浓度的确定

与正常组比较，DTA作用后的细胞存活率为89.65% ～94.90%，SH作用后的细胞存活率均超过100%，表明DTA和SH对L5178Y细胞无明显细胞毒性。根据《药物遗传毒性研究技术指导原则》［6］，结合DTA和SH药物的溶解能力，故确定DTA的500，250，125，62.5 μg/mL和SH的5 000，2 500，1 250，625 μg/mL作为正式试验剂量。详见表1和表2。

表1 DTA对L5178Y细胞存活率的影响

表2 SH对L5178Y细胞存活率的影响

2.2 非代谢活化下DTA和SH对L5178Y细胞的影响DTA和 SH在无 S9活化情况下对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞的毒性作用见表3。可见，随着DTA和SH给药剂量的增加，细胞的PE，RS，RSG和RTG均无明显下降，表明DTA和SH对L5178Y细胞无显著细胞毒性作用。与溶剂对照组比较，突变频率（MF）随着给药浓度增加并无明显上升趋势。

2.3 代谢活化下DTA和SH对L5178Y细胞的影响由表4可知，在代谢活化试验中，与不加S9的个剂量组类似，L5178Y细胞的PE，RS，RSG和RTG亦无明显下降。与溶剂对照组比较，DTA和SH给药组细胞MF亦无明显上升趋势。

表3 DTA和SH对L5178Y细胞TK基因的致突变性

表4 DTA和SH对L5178Y细胞TK基因的致突变性

3 讨论

小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）是Clive等于20世纪70年代建立的一种体外短期致突变检测方法，可检出包括点突变、大的缺失、重组、染色体异倍性和其他较大范围基因组改变在内的多种遗传改变，具有很高的灵敏度［7］。MLA的检测终点是TK基因的产物胸苷激酶，胸苷激酶在体内可催化脱氧胸苷（TdR）生成胸苷酸（TMP）的反应。正常情况下，此反应并非生命所必需的过程，但如果将胸苷类似物（如三氟胸苷、TFT）加入到细胞培养物中，则TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，进而掺入DNA，造成细胞致死性突变。而当TK基因发生突变（tk+/-→tk-/-）导致胸苷激酶缺陷时，则TFT不能磷酸化，亦不能掺入DNA，故细胞在含有TFT的培养基中能够生长，即表现除对TFT的抗性［8］。

曼陀罗种子含有0.2%～0.4%的生物碱，其中主要以东莨菪碱、莨菪碱和阿托品等毒性成分为主［9-10］。曼陀罗子中毒量种子为2～30粒，中毒症状有头晕、呕吐、心慌、幻视，严重者出现意识丧失、瞳孔散大、昏迷等，因此曼陀罗子对机体的毒性作用值得关注。在前期预试验中，利用MTT比色法检测15.625，31.25，62.5，125，250，500 μg/mL的 DTA及 10，100，1 000，10 000 μg/mL的SH对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞的毒性作用，结果表明DTA和SH对L5178Y细胞存活率均无显著降低作用。

本试验中，500 μg/mL是DTA在DMSO中的最大溶解量，而10 g/L的SH对L5178Y细胞亦无明显毒性作用，因此根据《药物遗传毒性研究技术指导原则》，确定500 μg/mL的DTA和5 g/L的SH作为正式试验最高剂量。本试验中利用62.5，125，250，500 μg/mL的DTA和625，1 250，2 500，5 000 μg/mL的SH在非活化（不加S9）和活化（加S9）情况下对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞进行诱导，结果显示，随着DTA和SH给药剂量的增加，细胞的PE，RS，RSG和RTG均无明显下降，提示DTA和SH对L5178Y细胞无显著细胞毒性作用。与溶剂对照组比较，随着给药浓度的增加，DTA和其最主要的生物碱成分东莨菪碱处理后的L5178Y细胞突变频率（MF）并未出现明显上升趋势，提示62.5～500 μg/mL的DTA和625～5 000 μg/mL的SH对小鼠淋巴瘤细胞TK基因无致突变作用。但目前遗传毒性评价中，通常采用体外和体内遗传毒性试验组合的方法，以减少遗传毒性受试物的假阴性结果。因此，曼陀罗子是否确无遗传毒性，还需进一步通过体内骨髓细胞染色体畸变或Ames致突变等实验进行验证。

［1］新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所.中华本草-维吾尔药卷［M］.上海：上海科学技术出版社，2005：340.

［2］热比姑丽·伊斯拉木，尤力都孜·买买提，艾西木江·热甫开提，等.新疆曼陀罗子炮制品一般毒性研究［J］.中国基层医药，2010，17（19）：2 595-2 597.

［3］李治建，阿不都吉力力，闫 明，等.曼陀罗子提取物小鼠急性毒性实验研究［J］.中国民族医药杂志，2010（5）：41-42.

［4］李治建，凯赛尔·阿不都克热木，阿不都吉力力·阿不都艾尼，等.曼陀罗子提取物对Beagle犬长期毒性实验研究［J］.医药导报，2011，30（4）：419-422.

［5］GB 15193.20-2003，TK基因突变试验标准 ［S］.

［6］［ZH］GPT 2-1，药物遗传毒性研究技术指导原则［S］.

［7］笪红远，曾文，江振洲，等.大黄酸对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因的致突变作用［J］.中草药，2008，39（12）：1 858-1 860.

［8］邬 鸣.用小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变实验评价三种黄酮类化合物的诱变性和抗诱变性［D］.成都：四川大学，2005.

［9］刘勇民.维吾尔药志（下册）［M］.乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：760.

［10］海热尼沙·黑提甫.探讨新疆曼陀罗子急性毒性及其生物碱含量间的关系［J］.中国民族民间医药，2012，21（21）：2-3.

Semen Daturae Induced TK Gene Mutation in Mouse L5178Y Cells

Peng Xiaoming，Huo Shixia，Gao Li，Yan Ming
（Institute of Xinjiang Traditional Uyghur Medicine·Prescription Laboratory of Xinjiang Traditional Uyghur Medicine，Wulumuqi，Xinjiang，China 830049）

Objective To investigate the TK gene mutation in mouse lymphoma cell induced by semen daturae.Methods L5178Y cell was treated for 3 h by 62.5，125，250，500 μg/mL of total alkaloids of semen daturae or 625，1 250，2 500，5 000 μg/mL of scopolamine hydrobromide in the activation of metabolic and non-metabolic activation conditions.The supernatant fluid was discarded，and the DMEM media was added to continue developing for 48 h.The number of mutations cell colony in each group was calculated after L5178Y cell was cultured in 96 well plate with TFT.Results Compared with the control group，the mutation rates of L5178Y had no significant increased after total alkaloids of semen daturae or scopolamine hydrobromide treated.Conclusion 62.5-500 μg/mL semen daturae and 625-5 000 μg/mL scopolamine hydrobromide have no mutation effect on TK gene in mouse lymphoma cell.

semen daturae；scopolamine hydrobromide；L5178Y；TK gene；mutation

彭晓明（1983-），男，湖南祁东人，硕士研究生，研究方向为细胞与分子药理学，（电子信箱）pxm1983@163.com；闫明（1959-），男，山西原平人，研究员，主要从事药物分析与新药研发工作，本文通讯作者，（电子信箱）yanming21cn@sohu.com。

2016-06-13）

新疆维吾尔自治区中医民族医药人才培养计划项目，项目编号：Q2015-03-05。

R285．5；R282．71

A

1006－4931（2016）19－0017－04