结直肠癌组织中Syndecan-1与EGFR表达及KRAS突变的关系

原少斐 朱林佳 郑维锷 张武 孙洪雨

结直肠癌组织中Syndecan-1与EGFR表达及KRAS突变的关系

原少斐 朱林佳 郑维锷 张武 孙洪雨

目的 探讨结直肠癌患者中多配体蛋白聚糖-1（Syndecan-1)与表皮生长因子受体（EGFR）表达及鼠类肉瘤病毒癌基因（KRAS）突变的关系。方法 选择原发性结直肠癌标本160例，结肠部肿瘤112例，直肠部肿瘤48例；病理类型为腺癌156例，其它病理类型4例。利用免疫组化法检测组织标本中Syndecan-1和EGFR的表达情况，运用直接测序法检测组织标本中KRAS基因外显子2第12、第13位密码子的突变状态。采用Spearman相关分析Syndecan-1的表达与EGFR表达及KRAS基因突变的关系。结果 肿瘤标本中Syndecan-1表达阳性41例，主要位于细胞膜20例，主要位于细胞浆16例，细胞膜与细胞浆同时表达5例。EGFR在结直肠癌中的阳性表达率69.4%，所有结直肠癌患者中发生KRAS突变率为37.5%。Syndecan-1的表达在肿瘤区域淋巴结有无转移、有无远处转移中差异均无统计学意义（均P＞0.05）。Syndecan-1的表达与EGFR表达呈显著相关（r=1.488，P＜0.01），而与KRAS状态无相关性（r=9.278，P＞0.05）。结论 Syndecan-1的表达可能对结直肠癌患者的进展及预后判断有一定价值。

多配体蛋白聚糖-1 表皮生长因子受体 鼠类肉瘤病毒癌基因 结直肠癌

多配体蛋白聚糖-1（Syndecan-1）属于整合素黏附分子跨膜硫酸蛋白多聚糖（HPSG）家族的成员，是一种表达于成熟上皮细胞、前B细胞及浆细胞表面的跨膜蛋白聚糖，分子量约85～92kD，可特异性结合一些有生物活性的小分子物质，主要参与调控细胞的生长、分化以及迁移等[1]。Syndecan-1能够促进细胞之间的黏附，阻止细胞的侵袭和脱落，进而限制肿瘤细胞的恶性表型，在控制恶性肿瘤细胞生长和转移等过程中有重要作用。Syndecan-1在一些上皮来源肿瘤或癌前病变组织中表达降低或缺失，可作为判断肿瘤预后的指标[2-3]。KRAS是RAS癌基因家族成员，位于染色体12p12.1，在细胞生长以及血管生成等相关的信号转导通路中起着重要调控作用，与肿瘤的发生、发展密切相关[4-5]。KRAS是EGFR信号通路下游的重要癌基因。有报道在结直肠癌中KRAS突变率在30%～40%[6]。最常见的突变发生在第2号外显子的第12和13密码子。大量临床试验证实Cetuximab或Panitumumab联合治疗野生型KRAS结直肠癌的有效率为41%～61%，而对KRAS突变者几乎无效，因此KRAS突变被认为是抗EGFR单抗疗效不佳的独立预后因素[7-8]。本研究通过免疫组化法检测Syndecan-1的表达，分析其与EGFR表达及KRAS突变的关系，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选择2009年6月至2014年12月本院肿瘤外科和胃肠外科手术切除的原发性结直肠癌标本160例，患者中男106例，女54例；年龄33～78（52.0±4.8）岁；腺癌156例，未分化癌2例，鳞癌1例，印戒细胞癌1例，其它病理类型4例；浸润深度pT1～2期28例，pT3～4期132例；有淋巴结转移112例。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有标本采集前均与患者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 组织芯片制作 构建2个8×8点阵的组织芯片，一个用于免疫组化染色，一个用于阴性对照。标本经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，厚度3μm连续切片。对制成芯片的所有组织进行点阵标记。根据标记，利用点阵仪对标记完成的组织进行打点取样，黏附于涂有多聚赖氨酸的载玻片上。每例标本取1个点。烤片6 h，芯片制作完成。

1.2.2 免疫组化SP法 SP试剂盒购于北京中杉生物技术有限公司，鼠抗人Syndecan-1、EGFR单克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司。将待检标本切片后经二甲苯及梯度乙醇脱蜡至水，3%H2O2作用15min，以阻断内源性过氧化物酶活性；切片置10mmol/L柠檬酸缓冲液中微波加热以修复抗原；冷却后滴加山羊血清封闭液，室温孵育15min，封闭非特异性抗体。去掉多余血清，加入一抗，4℃过夜。滴加生物素标记羊抗鼠IgG、辣根过氧化物酶一链霉菌卵白素工作液，室温孵育各15min，DAB显色，苏木素复染，脱水，封片。阴性对照以PBS代替一抗。

1.2.3 免疫组化结果判断 按半定量积分法判断表达[9]，根据染色强度及阳性细胞所占比例分别记为0～3分。染色强度：未着色为0分，着色浅为1分，中度着色为2分，着色深为3分。阳性细胞百分率：高倍镜下随机选取10个视野，每个视野计数100个细胞，计算平均阳性细胞百分率。阳性细胞数百分率≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～49%为2分，≥50%为3分。两项评分相加，0～1分为（-），2分为（+），3～4分为（++），5～6分为（+++），（+）、（++）、（+++）均视为阳性。

1.2.4 KRAS突变检测 样本DNA的提取：选择经HE染色证实存在癌组织并占60%以上的蜡块，切取3张厚度为10μm组织，装入1.5ml已消毒离心管，常规脱蜡处理后，加入蛋白酶K至终浓度1mg/ml，十二烷基硫酸钠（SDS）至2%。孵育24～36h后，离心处理（15 000r/ min，15min，4℃）。抽取石蜡层下的液体。按照QIAamp DNA FFPF Kit试剂盒（德国Qiagen公司）步骤提取石蜡组织DNA，最后以30μl洗脱液洗脱DNA，DNA产物用紫外分光光度计检测DNA浓度，调节到100μg/ml，-20℃保存备用。KRAS基因的PCR扩增及测序：根据文献[10]，选择扩增12/13号密码子所需特异性引物，引物序列为：5′：AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATA-3′（正义）；5′：CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3′（反义）。PCR反应体系50μl，包含2μl模版DNA，10μmol/L正、反各1μl，25μl Premix（含1.5U TaKaKa Taq；10×PCR Buffer，3.0 mmol/L Mg2+；0.4 mmol/L dNTP Mix），引物及PremixPCR检测试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司。PCR反应条件：94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃40s，循环30次，循环结束4℃保持，PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统观察和分析结果。选取PCR阳性DNA凝胶条带作为目的片段，采用QIAquick PCR Purification Kit对PCR产物进行回收（Qiagen公司产品），后送至上海基因技术有限公司测序。1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件，计数资料以百分率表示，比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman相关。

2 结果

2.1 Syndecan-1表达 Syndecan-1表达阳性41例，阳性表达率为25.6%，阳性表达的肿瘤细胞细胞膜和细胞质可见棕黄色颗粒（插页图1-4）；其中Syndecan-1的表达主要位于细胞膜20例，主要位于细胞质16例，细胞膜与细胞质同时表达5例。

2.2 不同临床病理特征中Syndecan-1表达情况 见表1。

由表1可见，Syndecan-1表达在肿瘤浸润深度方面差异有统计学意义（P＜0.05），在患者性别、年龄、有无淋巴结转移、有无远处转移及肿瘤分化程度方面差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.3 EGFR表达 EGFR表达阳性111例，阳性表达率69.4%，主要表达于细胞膜，呈棕黄色细颗粒状（插页图5-6）。

表1 不同临床病理特征中Syndecan-1表达情况（例）

2.4 KRAS突变情况 发生KRAS突变60例，突变率为37.5%；其中13密码子突变10例，均为G13D（10/ 60，16.7%）；12密码子突变50例（50/60，83.3%），共检出5种突变类型，G12D突变率最高（21/60，35.0%），其余依次为G12V（15/60，25.0%），G12A（11/60，18.3%），G12C（10/60，16.7%），G12S（3/60，5.0%）。

2.5 Syndecan-1与EGFR表达及KRAS突变的关系见表2。

表2 Syndecan-1与EGFR表达及KRAS突变的关系（例）

由表2可见，结直肠癌患者中Syndecan-1的表达与EGFR表达显著相关（r=1.488，P＜0.01），而与KRAS基因是否突变无相关性（r=9.278，P＞0.05）。

3 讨论

Syndecan-1是一种表达于成熟上皮细胞、浆细胞、前B细胞表面的跨膜蛋白聚糖，其硫酸乙酰肝素侧链上可特异性地结合多种生物活性分子，与脂蛋白、病原体等胞吞吐作用有关。Syndecan-1的功能主要有：（1）隔离保护生长因子等免被蛋白酶降解，并协调其与相应受体的结合；（2）与细胞外基质（ECM）结合，增强细胞黏附；（3）以共受体的方式调节细胞与微环境之间的相互作用，参与血管形成、组织器官分化发育、组织再生等一系列生理过程的调节。Syndecan-1通过与其共价连接的硫酸肝素侧链结合一系列的细胞外配体，介导细胞-ECM、细胞-细胞间黏附，被认为在调节细胞间联合和生长因子信号传递中发挥了重要作用[11-12]。Syndecan-1的表达在维持正常上皮形态结构的完整性和稳定性、影响细胞迁移的同时还以共受体方式调控细胞增殖，参与肿瘤的发生、发展过程。在一些上皮来源的肿瘤或癌前病变，如头颈部肿瘤、肺癌、乳腺癌及胃癌中，Syndecan-1的表达降低或缺失，并且与临床预后相关[13]。有研究发现，Syndecan-1在细胞膜上的表达对维持正常肠道黏膜细胞的形态至关重要[14]；其在大肠腺瘤向大肠癌的转化中表达缺失，导致细胞丧失生长抑制功能，使肿瘤细胞能大量增殖，并具有极强的侵袭活性。

本文研究结果显示，Syndecan-1在正常结直肠黏膜组织和结直肠癌中均有阳性表达，主要分布在细胞膜和（或）细胞浆，阳性信号为棕黄色颗粒染色，结直肠癌标本组织中Syndecan-1阳性表达率仅为25.6%（41/160），低于正常黏膜的表达。Syndecan-1表达在患者不同年龄、性别、结直肠癌分化程度及是否淋巴结转及远处转移差异均无统计学意义，但在肿瘤浸润深度方面差异有统计学意义，在一定程度上说明Syndecan-1的表达在结直肠癌发生、发展的过程中逐渐缺失。有关Syndecan-1与结直肠癌临床预后的关系，有学者报道Syndecan-1表达阴性的结直肠肿瘤患者临床预后较差，生存时间短[15]。因本研究未涉及到随访，以后将重点随访这些患者的生存时间来明确Syndecan-1的表达与结直肠癌患者预后的相关性。

在全球范围内，结直肠癌的发病率逐渐攀升，其发病率居世界第3位[16]。结直肠癌的治疗一直是国内外学者研究的热点。随着靶向治疗药物表皮生长因子受体（epidermal growth factorreceptor，EGFR）抑制剂西妥昔单抗（cetuximab）和帕尼单抗（panitumumab）的问世，目前结直肠癌的治疗进入精准医学指导下的靶向个体化治疗时代。EGFR是Ⅰ型受体酪氨酸激酶，是原癌基因ErbB-1的表达产物，在多种上皮来源的恶性肿瘤中过表达，当其与配体结合时，通过激活酪氨酸蛋白激酶途径，可促进肿瘤细胞生长和迁移、肿瘤血管形成及抑制肿瘤细胞凋。Ras蛋白（包括KRAS和NRAS）过度表达是细胞增生的标志，RAS基因是EGFR信号转导通路中一个重要的下游调控基因，其阳性表达是肿瘤发生的早期事件。KRAS可由基因突变、自身活化或在接受EGFR的信号后发生过表达，这种过表达被认为是包括大肠癌在内的很多上皮源性恶性肿瘤的发生机制[17]。研究显示，西妥昔单抗治疗的有效性受其下游基因RAS状态的影响[18]。突变型的RAS基因无需EGFR接受信号，能够自动活化该通路并启动下游信号的转导，因此只有野生型RAS基因的患者才对抗EGFR单克隆抗体的治疗有效，而突变型的患者无效。国外文献报道，EGFR在结直肠癌组织中的阳性率为60%～75%[19]。本研究中，EGFR在结直肠癌组织中的阳性表达率为69.4%，与国外的研究结果相符。本研究同时分析了Syndecan-1的表达与EGFR表达及KRAS基因的关系，发现结直肠癌患者中Syndecan-1的表达与EGFR表达显著相关，而与KRAS基因是否突变无相关性。

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Expressions of Syndecan-1,EGFR and KRAS gene mutations in colorectal carcinoma

YUAN Shaofei,ZHU Linjia,ZHENG Wei'e,etal.Department of Medical Oncology,The Third Affiliated Hospital,Wenzhou Medical University,Rui'an 325200, China

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of Syndecan-1,EGFR and KRAS gene mutations in colorectal carcinoma. Methods The expressions of Syndecan-1 and EGFR were detected by immunohistochemistry in surgical specimens of 160 patients with primary colorectal carcinoma treated between 2009 and 2014 at our Hospital.DNA sequencing was used to detect mutations in KRAS(codons12,13 of exon2).The relationship between Syndecan-1 expression and various clinicopathologicalparameters and molecular markers was analyzed.Results There were 156(97.5%)cases ofadenocarcinomas, and 4(2.5%)cases of other pathological types.Syndecan-1 expression was identified in 41(25.6%)colorectal cancer cases, among which 20 showed predominantly membranous immunopositivity,16 showed a predominantly cytoplasmic staining,and 5 showed mixed membranous and cytoplasmic staining.The positive rate of EGFR expression was 69.4%,and KRAS mutations rate was 37.5%in 160 colorectal cancer cases.The expression of Syndecan-1 was significantly correlated with EGFR expression (r=1.488,P＜0.01),however,it was not correlated with KRAS mutations(r=9.278,P＞0.05),lymph node metastasis and distant metastasis(P＞0.05). Conclusion The expression profile of Syndecan-1 may be of clinical value in colorectal cancer and may help in identifying aggressive forms of colorectal carcinoma.

Syndecan-1 EGFR KRAS Colorectal carcinoma

2015-12-14）

（本文编辑：马雯娜）

325200 温州医科大学附属第三医院肿瘤中心

朱林佳，E-mail：ysf1004@163.com